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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒一直连接不上，求助。。。。
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吗子

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒一直连接不上，求助。。。。 已有7人参与

我最近构建一个质粒，将目的基因片段（250bp）,连接到表达载体上（1 5000 bp）。但是连接后涂扳一直没上出想要的菌落来。方法如下：

先将目的基因连接于T载体，然后同时用kpn 1 和 sac 1 双酶切 T载体 和表达载体，并凝胶电泳回收目的片段及双酶切后的表达载体，然后进行重组连接。
连接用的TAKARA T4酶 10ul体系。1ul 酶，1ul buffer,其余加载体和片段，试了很多比例（载体：片段=1:1,3:1,10:1,20:1 1:10 都没有成功），连接16℃过夜12-14h。

涂扳后16小时内基本不长什么菌落，或者长的话也很小根本不好挑，长大了挑做PCR要么阴性要么假阳性。做了快2个月了，一直不知道问题出在哪啊，都要崩溃了。特在此求助各位虫友啦。谢谢啦

附上我胶回收的2张图片，请大家帮忙分析一下啊，不胜感激。

重组质粒一直连接不上，求助。。。。
左边为双酶切的表达载体质粒，右边是目的片段.jpg


重组质粒一直连接不上，求助。。。。-1
胶回收后的电泳.jpg
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深秋
1楼 2015-08-26 11:24:46
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renzhiq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

载体的问题，酶切没有切好！首先保证你的载体没有被酶切操作过的原始质粒。然后是分别用两个酶单独切载体，观察电泳条带变化，判断两个酶是否都能切开。再用另外一个酶切后，连接……
总之是保证酶切没有问题，定能成功……

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17楼2015-09-12 08:39:53
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
吗子: 金币+20, ★★★很有帮助, 感谢你第一个解答我的问题 2015-08-26 12:18:24
问题应该出在T4酶或者你的盘子

建议你做一个T4酶的阳性对照，例如用T4酶连接blunt end切的质粒，看能不能长

我的经验是一般很小的菌落都不是真的，可能你用的抗生素不对或者浓度太高

有时候insert如果带有毒性也不好克隆，可以试试换个菌株 例如 JM109

祝你成功！
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2楼2015-08-26 11:35:01
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吗子

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-26 11:35:01
问题应该出在T4酶或者你的盘子

建议你做一个T4酶的阳性对照，例如用T4酶连接blunt end切的质粒，看能不能长

我的经验是一般很小的菌落都不是真的，可能你用的抗生素不对或者浓度太高

有时候insert如果带有 ...

T4酶换的是新的，培养基也是新的，做另一个克隆的时候也没有问题呢。
blunt end切的话最具怎么操作呢？
之前用这个表达载体也重组过了个质粒。而且抗生素已经减量了，但还是一样的结果。 我之前用的感受态是全式金的Trans1-T1 和Trans10，但是结果都这样。怎么知道插入片段是否有毒性呢？
先谢谢啦
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深秋
3楼2015-08-26 12:17:08
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huangxun2000

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-27 23:00:38
也可能是胶电泳回收目的片段的问题，wash buffer 没有干导致体系有乙醇影响重组反应。或者洗脱液最好少加一些，尽量让浓度提高，洗脱液少些。
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4楼2015-08-26 20:31:41
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