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吗子金虫 (小有名气)
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重组质粒一直连接不上，求助。。。。已有7人参与
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我最近构建一个质粒，将目的基因片段（250bp）,连接到表达载体上（1 5000 bp）。但是连接后涂扳一直没上出想要的菌落来。方法如下： 先将目的基因连接于T载体，然后同时用kpn 1 和 sac 1 双酶切 T载体 和表达载体，并凝胶电泳回收目的片段及双酶切后的表达载体，然后进行重组连接。 连接用的TAKARA T4酶 10ul体系。1ul 酶，1ul buffer,其余加载体和片段，试了很多比例（载体：片段=1:1,3:1,10:1,20:1 1:10 都没有成功），连接16℃过夜12-14h。 涂扳后16小时内基本不长什么菌落，或者长的话也很小根本不好挑，长大了挑做PCR要么阴性要么假阳性。做了快2个月了，一直不知道问题出在哪啊，都要崩溃了。特在此求助各位虫友啦。谢谢啦 附上我胶回收的2张图片，请大家帮忙分析一下啊，不胜感激。   左边为双酶切的表达载体质粒，右边是目的片段.jpg  胶回收后的电泳.jpg |
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huangxun2000
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