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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双抗平板中长出了菌落，不知道是不是自己所要的重组菌
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

[求助] 双抗平板中长出了菌落，不知道是不是自己所要的重组菌已有3人参与

自己做重组菌也做了好久了，一直没有做成功。目前在用的事PET32a质粒，这一次是目的基因和质粒酶切之后都没有做胶回收，用PCR产物纯化试剂盒纯化了下酒直接做了连接转化。筛选就是采用的氨苄和卡纳抗性筛选，在双抗平板上长出了菌落，初步P菌落PCR并没有得到想要的电泳条带。请问，如果不是我要的重组子，又会是什么呢？竟然还具有双抗性？
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1楼2014-03-17 22:46:33
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-18 08:49:37
摇菌后用菌液PCR看看，这个比菌落PCR效果好一点。我印象里pET系列的载体是单抗性的，怎么会用双抗啊！
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2楼2014-03-17 23:18:23
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liuderong at 2014-03-17 23:18:23
摇菌后用菌液PCR看看，这个比菌落PCR效果好一点。我印象里pET系列的载体是单抗性的，怎么会用双抗啊！

目的基因和PET32a质粒重组连接了下，在双抗平板上就长出来了一些菌落。。
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3楼2014-03-18 12:45:16
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691806321

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌落PCR很不准确的，不确定因素太多。好多情况都是菌落PCR是阳性，酶切鉴定不是。建议挑几个菌落摇菌提质粒，酶切鉴定下，就算不是，也知道问题出在哪里，下次做时可以注意。此外，氨苄，卡纳抗性平板上长了，也不一定就是你要的重组菌，是杂菌的可能性也有。要具体看看菌落的形态。
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4楼2014-03-18 14:49:40
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jjjhhbbb

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很可能是杂菌，一般是菌落PCR鉴定是不是你要的目的基因，当然提质粒检测更准确
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5楼2014-03-18 15:18:01
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jjjhhbbb at 2014-03-18 15:18:01
很可能是杂菌，一般是菌落PCR鉴定是不是你要的目的基因，当然提质粒检测更准确

哎  经导师鉴定，做错了。
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6楼2014-03-18 18:22:58
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