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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

[求助] 双抗平板中长出了菌落,不知道是不是自己所要的重组菌 已有3人参与

自己做重组菌也做了好久了,一直没有做成功。目前在用的事PET32a质粒,这一次是目的基因和质粒酶切之后都没有做胶回收,用PCR产物纯化试剂盒纯化了下酒直接做了连接转化。筛选就是采用的氨苄和卡纳抗性筛选,在双抗平板上长出了菌落,初步P菌落PCR并没有得到想要的电泳条带。请问,如果不是我要的重组子,又会是什么呢?竟然还具有双抗性?
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-18 08:49:37
摇菌后用菌液PCR看看,这个比菌落PCR效果好一点。我印象里pET系列的载体是单抗性的,怎么会用双抗啊!
2楼2014-03-17 23:18:23
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by liuderong at 2014-03-17 23:18:23
摇菌后用菌液PCR看看,这个比菌落PCR效果好一点。我印象里pET系列的载体是单抗性的,怎么会用双抗啊!

目的基因和PET32a质粒重组连接了下,在双抗平板上就长出来了一些菌落。。
3楼2014-03-18 12:45:16
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691806321

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
菌落PCR很不准确的,不确定因素太多。好多情况都是菌落PCR是阳性,酶切鉴定不是。建议挑几个菌落摇菌提质粒,酶切鉴定下,就算不是,也知道问题出在哪里,下次做时可以注意。此外,氨苄,卡纳抗性平板上长了,也不一定就是你要的重组菌,是杂菌的可能性也有。要具体看看菌落的形态。
4楼2014-03-18 14:49:40
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jjjhhbbb

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
很可能是杂菌,一般是菌落PCR鉴定是不是你要的目的基因,当然提质粒检测更准确
5楼2014-03-18 15:18:01
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by jjjhhbbb at 2014-03-18 15:18:01
很可能是杂菌,一般是菌落PCR鉴定是不是你要的目的基因,当然提质粒检测更准确

哎  经导师鉴定,做错了。
6楼2014-03-18 18:22:58
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