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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » sacB负筛选遇到的问题？
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dongdong85

铜虫 (初入文坛)

[求助] sacB负筛选遇到的问题？ 已有1人参与

我打算用sacB负筛选的方法敲除aeromonas hydrophila基因，基本流程是这样的：将基因上下游500bp序列连接起来后连到pre112敲除质粒上（转大肠杆菌WM3064)，然后结合转移到aeromonas hydrophila中，在氯霉素平板上得到第一次重组克隆，挑单克隆接种到无氯化钠LB小管中（含氯霉素），用上游正向引物和下游反向引物扩增可以得到两条带（一条正常大小，一条敲除大小片段），然后挑阳性克隆接种到无氯化钠LB小管中（不含氯霉素），长出后稀释涂10%蔗糖平板，得到第二次重组克隆，用基因外围扩增一直得不到敲除菌。
目前：有几个现象。1.大肠杆菌WM3064阳性克隆（含pre112和敲除片段）在DAP+LB+氯霉素平板可以生长，但在蔗糖+DAP+LB+氯霉素平板不生长，证明sacB基因应该没有失活。
2.第一次重组克隆在LB+氯霉素平板可以生长，但在蔗糖+LB+氯霉素平板也生长，挑了100多个都是这样，理论上阳性克隆（含sacB）应该对蔗糖敏感。
3.第二次重组克隆在LB+蔗糖平板可以生长，但在LB+氯霉素平板也生长，挑了200多个都是这样，理论上阳性克隆经过第二次重组丢掉氯霉素和sacB应该对氯霉素敏感。

我现在不清楚到底是我这个菌对蔗糖不敏感还是sacB基因失效了。请教大家有没有什么好办法解决这个问题。
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加油，努力
1楼 2015-09-21 15:21:49
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dongdong85: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-09-23 15:00:09
现象2可以看出是ScaB基因不敏感，可能是没表达，可能是剂量不够。提高蔗糖浓度试试，如果不行就只能换个筛选标记。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-09-21 20:14:25
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ywJ冗

新虫 (初入文坛)
请问您后来怎么解决的呢
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3楼2018-12-28 17:57:14
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