| 查看: 3299 | 回复: 2 | |||
dongdong85铜虫 (初入文坛)
|
[求助]
sacB负筛选遇到的问题？ 已有1人参与
|
|
我打算用sacB负筛选的方法敲除aeromonas hydrophila基因，基本流程是这样的：将基因上下游500bp序列连接起来后连到pre112敲除质粒上（转大肠杆菌WM3064)，然后结合转移到aeromonas hydrophila中，在氯霉素平板上得到第一次重组克隆，挑单克隆接种到无氯化钠LB小管中（含氯霉素），用上游正向引物和下游反向引物扩增可以得到两条带（一条正常大小，一条敲除大小片段），然后挑阳性克隆接种到无氯化钠LB小管中（不含氯霉素），长出后稀释涂10%蔗糖平板，得到第二次重组克隆，用基因外围扩增一直得不到敲除菌。 目前：有几个现象。1.大肠杆菌WM3064阳性克隆（含pre112和敲除片段）在DAP+LB+氯霉素平板可以生长，但在蔗糖+DAP+LB+氯霉素平板不生长，证明sacB基因应该没有失活。 2.第一次重组克隆在LB+氯霉素平板可以生长，但在蔗糖+LB+氯霉素平板也生长，挑了100多个都是这样，理论上阳性克隆（含sacB）应该对蔗糖敏感。 3.第二次重组克隆在LB+蔗糖平板可以生长，但在LB+氯霉素平板也生长，挑了200多个都是这样，理论上阳性克隆经过第二次重组丢掉氯霉素和sacB应该对氯霉素敏感。 我现在不清楚到底是我这个菌对蔗糖不敏感还是sacB基因失效了。请教大家有没有什么好办法解决这个问题。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有124人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
-
ALK5 高选择性小分子 LY-3200882：可放大合成路线与质控要点解析
已经有0人回复
zhaodahe
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 220 (大学生)
- 金币: 1796.6
- 红花: 7
- 帖子: 461
- 在线: 378.5小时
- 虫号: 552612
- 注册: 2008-04-30
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
2楼2015-09-21 20:14:25
ywJ冗
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 152.4
- 散金: 5
- 帖子: 15
- 在线: 16.5小时
- 虫号: 5628941
- 注册: 2017-02-18
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
3楼2018-12-28 17:57:14
30