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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

[求助] 请问为什么测序对了的重组质粒,双酶能切出其他条带 已有4人参与

做表达做了快一年了一直没有表达出来,心里快急死了···

是一个pet30与目的基因的重组质粒,目的基因117bp,总共只有11kDa大小的氨基酸,尝试了多次诱导表达都不成功

测序没有问题(只测了T7启动子后的序列,加上插入的目的基因序列,跟给出的pet30序列图是完全相同的,翻译成氨基酸理论上也可以正常表达)

目前在找问题,发现酶切这个地方一直有问题没有解决

请问为什么测序对了的重组质粒,双酶能切出其他条带
这个是提取的质粒的照片
之后将此质粒转化入其他BL21和DH5a,测序也都正确;

请问为什么测序对了的重组质粒,双酶能切出其他条带-1
这个是将此质粒进行双酶切的电泳照片
请问为什么在1000多和3000多的地方也有条带呢?
按理说商业质粒不应该会有其他部位能切开的吧?请问这是什么原因呢?
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by sdjnyxn123 at 2015-12-27 17:38:09
是takara的,消化了6小时左右

星号活性了解过,但是不太清楚是哪里不对,按理说试剂盒里应该不会有乱七八糟的东西吧···我去借其他实验室的做一下看看...

6个小时有点太久了,但如果是takera快酶系列的应该没什么问题,可以半个小时尝试一下啊。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
7楼2015-12-27 20:30:19
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查看全部 11 个回答

liuxinyueer

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.商业质粒查看质粒图谱、序列,EcoRI和XhoI切后明显有多条条带。
2.异源表达建议用偏好密码子
3.查看T7启动子是否在目的细胞中属于强启动子
欢迎讨论,小木虫未能及时回复,请邮箱: lmzhang1994@gmail.com
2楼2015-12-26 20:32:25
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从提取的质粒看质量不是很好,存在很多开环或线性质粒,试想一下线性质粒被单酶切有没有出现上述情况呢?
生物科学
3楼2015-12-26 20:47:55
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你知道星号活性么,消化了多久?用的哪家的酶。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
4楼2015-12-27 11:36:40
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