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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 诱导不表达
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1296785943

铁虫 (初入文坛)

[求助] 诱导不表达 已有4人参与

我的目的因为2.8kb,用pet28a-sumo的载体进行重组表达。重组后用质粒进行PCR可以扩出目的条带；酶切鉴定也是对的，测序存在三个点突变，但用NCBI中的ORF finder进行分析结果如图：
       从图来看，我的重组质粒应该没问题。但我将重组质粒转化到BL21（DE3）中，在18、37 摄氏度均不表达。请问这是什么原因？！之前我用pet17b做载体可成功在BL21（DE3）中表达，可这次换个载体为什么在BL21（DE3）中就不表达了？！！
       急需帮助，谢谢！！！

诱导不表达
图片1.jpg
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1楼 2014-03-24 19:10:29
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
测序存在三个点突变，会不会是因为这个？而且，突变了你也敢用啊。
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2楼2014-03-24 19:24:10
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1296785943

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-24 19:24:10
测序存在三个点突变，会不会是因为这个？而且，突变了你也敢用啊。

但是做阅读框的分析可以翻译出1093个AA呀，将翻译 的氨基酸做同源比对，

比对结果中含目的序列中的保守结构域，载体上的标签也在！
我需要重新做重组吗？
诱导不表达-1
图片3.jpg
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3楼2014-03-25 08:56:17
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 1296785943 at 2014-03-25 08:56:17
但是做阅读框的分析可以翻译出1093个AA呀，将翻译 的氨基酸做同源比对，

比对结果中含目的序列中的保守结构域，载体上的标签也在！
我需要重新做重组吗？

图片3.jpg
...

这个高难度的问题还是问下你实验室的师兄师姐吧，。我也坐等大神。
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4楼2014-03-25 15:35:02
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1296785943

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-25 15:35:02
这个高难度的问题还是问下你实验室的师兄师姐吧，。我也坐等大神。...

目前实验室就我一个人做分子，请教其他实验室的人也不知道怎么回事。真是愁煞人呀！不过还是谢谢啦！
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5楼2014-03-25 20:43:15
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biology-boy

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
6楼2014-03-26 10:24:54
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by biology-boy at 2014-03-26 10:24:54
你用18 和37度 表达？ 这个温度不合适吧，一般我们都是二十几度，生长温度和诱导表达温度不宜相差太大的。

这个不能这么说的，我们实验室用37℃诱导的照样表达，要看情况而定
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
7楼2014-03-26 11:50:59
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m情深守护

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是需要诱导表达啊，或者还是你的目的基因太大了，表达的蛋白形成了包涵体呢？希望懂得人能够给予应助。

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2014-03-26 16:21:47
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议楼主诱导一下，我做的pet28a+的重组载体导入BL21（DE3）中，就是用IPTG诱导表达6h的，并且表达的蛋白是以包涵体形式存在的。
仅做参考
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9楼2014-03-26 17:17:19
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1296785943

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by rv1nm2y at 2014-03-26 17:17:19
建议楼主诱导一下，我做的pet28a+的重组载体导入BL21（DE3）中，就是用IPTG诱导表达6h的，并且表达的蛋白是以包涵体形式存在的。
仅做参考

我换了Rosetta的感受态，18度诱导表达了。还没来得 及分析是不是在包涵体表达。请问如果在包涵体表达，你们是怎么做纯化的呢？纯化效果怎么样？谢谢！！！
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10楼2014-03-28 10:45:45
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