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1296785943

铁虫 (初入文坛)

[求助] 诱导不表达已有4人参与

我的目的因为2.8kb,用pet28a-sumo的载体进行重组表达。重组后用质粒进行PCR可以扩出目的条带;酶切鉴定也是对的,测序存在三个点突变,但用NCBI中的ORF finder进行分析结果如图:
       从图来看,我的重组质粒应该没问题。但我将重组质粒转化到BL21(DE3)中,在18、37 摄氏度均不表达。请问这是什么原因?!之前我用pet17b做载体可成功在BL21(DE3)中表达,可这次换个载体为什么在BL21(DE3)中就不表达了?!!
       急需帮助,谢谢!!!

诱导不表达
图片1.jpg
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

测序存在三个点突变,会不会是因为这个?而且,突变了你也敢用啊。
2楼2014-03-24 19:24:10
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1296785943

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-24 19:24:10
测序存在三个点突变,会不会是因为这个?而且,突变了你也敢用啊。

但是做阅读框的分析可以翻译出1093个AA呀,将翻译 的氨基酸做同源比对,

比对结果中含目的序列中的保守结构域,载体上的标签也在!
我需要重新做重组吗?
诱导不表达-1
图片3.jpg

3楼2014-03-25 08:56:17
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 1296785943 at 2014-03-25 08:56:17
但是做阅读框的分析可以翻译出1093个AA呀,将翻译 的氨基酸做同源比对,

比对结果中含目的序列中的保守结构域,载体上的标签也在!
我需要重新做重组吗?

图片3.jpg
...

这个高难度的问题还是问下你实验室的师兄师姐吧,。我也坐等大神。
4楼2014-03-25 15:35:02
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1296785943

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-25 15:35:02
这个高难度的问题还是问下你实验室的师兄师姐吧,。我也坐等大神。...

目前实验室就我一个人做分子,请教其他实验室的人也不知道怎么回事。真是愁煞人呀!不过还是谢谢啦!
5楼2014-03-25 20:43:15
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biology-boy

禁虫 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

6楼2014-03-26 10:24:54
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

引用回帖:
6楼: Originally posted by biology-boy at 2014-03-26 10:24:54
你用18 和37度 表达? 这个温度不合适吧,一般我们都是二十几度,生长温度和诱导表达温度不宜相差太大的。

这个不能这么说的,我们实验室用37℃诱导的照样表达,要看情况而定
植根于内心的修养;无需提醒的自觉;以约束为前提的自由;为别人着想的善良
7楼2014-03-26 11:50:59
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m情深守护

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是需要诱导表达啊,或者还是你的目的基因太大了,表达的蛋白形成了包涵体呢?希望懂得人能够给予应助。

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-03-26 16:21:47
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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议楼主诱导一下,我做的pet28a+的重组载体导入BL21(DE3)中,就是用IPTG诱导表达6h的,并且表达的蛋白是以包涵体形式存在的。
仅做参考
9楼2014-03-26 17:17:19
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1296785943

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by rv1nm2y at 2014-03-26 17:17:19
建议楼主诱导一下,我做的pet28a+的重组载体导入BL21(DE3)中,就是用IPTG诱导表达6h的,并且表达的蛋白是以包涵体形式存在的。
仅做参考

我换了Rosetta的感受态,18度诱导表达了。还没来得 及分析是不是在包涵体表达。请问如果在包涵体表达,你们是怎么做纯化的呢?纯化效果怎么样?谢谢!!!
10楼2014-03-28 10:45:45
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