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rv1nm2y

银虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by 1296785943 at 2014-03-28 10:45:45
我换了Rosetta的感受态,18度诱导表达了。还没来得 及分析是不是在包涵体表达。请问如果在包涵体表达,你们是怎么做纯化的呢?纯化效果怎么样?谢谢!!!...

我们目的基因前面有6XHis标签,将包涵体复性透析,然后用Ni-NTA亲和层析,用咪唑洗
11楼2014-03-28 15:45:27
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1296785943(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-03-29 21:33:25
你的重组质粒的读码框没有问题。
如果再遇到这样的问题,你还可以关注一下起始密码子前面的RBS等区域,看看有没有问题,点背的话那些个位置突变,也是没有表达的。
你现在18度有了表达,应该就不是上述问题了。
你之前用pET17b,现在改用pET28+SUMO,而且表达的时候直接测试了18度,我猜你pET17b应该是包涵体了。SUMO融合会有一定的促溶解作用,可能会在胞质。
如果不幸还在包涵体里,由于你的蛋白带Histag纯化起来倒是很简单,离心收菌,破碎,弃上清,8M尿素溶解包涵体,然后Ni柱纯化(可以选择咪唑梯度洗脱,也可以算则pH梯度洗脱),在变性条件下,pH梯度有时要比咪唑梯度纯化的干净一些。
之后的问题就来了,如果你需要复性,那么将是一个很复杂而且成功率很低的过程,除非有类似蛋白的复性成功文献做参考。
还有就是,你的SUMO同目标蛋白(好象是RTS?)连接位置的氨基酸是QINGSM(你ORF finder图片417位置附近),由于氨基酸是NG不是GG,所以可能切不下来……
12楼2014-03-28 19:08:22
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