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10楼: Originally posted by 1296785943 at 2014-03-28 10:45:45
我换了Rosetta的感受态，18度诱导表达了。还没来得及分析是不是在包涵体表达。请问如果在包涵体表达，你们是怎么做纯化的呢？纯化效果怎么样？谢谢！！！...

我们目的基因前面有6XHis标签，将包涵体复性透析，然后用Ni-NTA亲和层析，用咪唑洗

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11楼2014-03-28 15:45:27

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woolley

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
1296785943(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-03-29 21:33:25

你的重组质粒的读码框没有问题。
如果再遇到这样的问题，你还可以关注一下起始密码子前面的RBS等区域，看看有没有问题，点背的话那些个位置突变，也是没有表达的。
你现在18度有了表达，应该就不是上述问题了。
你之前用pET17b，现在改用pET28+SUMO，而且表达的时候直接测试了18度，我猜你pET17b应该是包涵体了。SUMO融合会有一定的促溶解作用，可能会在胞质。
如果不幸还在包涵体里，由于你的蛋白带Histag纯化起来倒是很简单，离心收菌，破碎，弃上清，8M尿素溶解包涵体，然后Ni柱纯化(可以选择咪唑梯度洗脱，也可以算则pH梯度洗脱)，在变性条件下，pH梯度有时要比咪唑梯度纯化的干净一些。
之后的问题就来了，如果你需要复性，那么将是一个很复杂而且成功率很低的过程，除非有类似蛋白的复性成功文献做参考。
还有就是，你的SUMO同目标蛋白(好象是RTS?)连接位置的氨基酸是QINGSM(你ORF finder图片417位置附近)，由于氨基酸是NG不是GG，所以可能切不下来……

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12楼2014-03-28 19:08:22

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