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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 诱导不表达
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1296785943

铁虫 (初入文坛)

[求助] 诱导不表达 已有4人参与

我的目的因为2.8kb,用pet28a-sumo的载体进行重组表达。重组后用质粒进行PCR可以扩出目的条带；酶切鉴定也是对的，测序存在三个点突变，但用NCBI中的ORF finder进行分析结果如图：
       从图来看，我的重组质粒应该没问题。但我将重组质粒转化到BL21（DE3）中，在18、37 摄氏度均不表达。请问这是什么原因？！之前我用pet17b做载体可成功在BL21（DE3）中表达，可这次换个载体为什么在BL21（DE3）中就不表达了？！！
       急需帮助，谢谢！！！

诱导不表达
图片1.jpg
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1楼 2014-03-24 19:10:29
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1296785943(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-03-29 21:33:25
你的重组质粒的读码框没有问题。
如果再遇到这样的问题，你还可以关注一下起始密码子前面的RBS等区域，看看有没有问题，点背的话那些个位置突变，也是没有表达的。
你现在18度有了表达，应该就不是上述问题了。
你之前用pET17b，现在改用pET28+SUMO，而且表达的时候直接测试了18度，我猜你pET17b应该是包涵体了。SUMO融合会有一定的促溶解作用，可能会在胞质。
如果不幸还在包涵体里，由于你的蛋白带Histag纯化起来倒是很简单，离心收菌，破碎，弃上清，8M尿素溶解包涵体，然后Ni柱纯化(可以选择咪唑梯度洗脱，也可以算则pH梯度洗脱)，在变性条件下，pH梯度有时要比咪唑梯度纯化的干净一些。
之后的问题就来了，如果你需要复性，那么将是一个很复杂而且成功率很低的过程，除非有类似蛋白的复性成功文献做参考。
还有就是，你的SUMO同目标蛋白(好象是RTS?)连接位置的氨基酸是QINGSM(你ORF finder图片417位置附近)，由于氨基酸是NG不是GG，所以可能切不下来……
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12楼2014-03-28 19:08:22
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
测序存在三个点突变，会不会是因为这个？而且，突变了你也敢用啊。
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2楼2014-03-24 19:24:10
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1296785943

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-24 19:24:10
测序存在三个点突变，会不会是因为这个？而且，突变了你也敢用啊。

但是做阅读框的分析可以翻译出1093个AA呀，将翻译 的氨基酸做同源比对，

比对结果中含目的序列中的保守结构域，载体上的标签也在！
我需要重新做重组吗？
诱导不表达-1
图片3.jpg
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3楼2014-03-25 08:56:17
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 1296785943 at 2014-03-25 08:56:17
但是做阅读框的分析可以翻译出1093个AA呀，将翻译 的氨基酸做同源比对，

比对结果中含目的序列中的保守结构域，载体上的标签也在！
我需要重新做重组吗？

图片3.jpg
...

这个高难度的问题还是问下你实验室的师兄师姐吧，。我也坐等大神。
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4楼2014-03-25 15:35:02
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