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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 我pcr之后跑胶的条带模糊不清，但是能看出有条带，Marker也一样的？
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潇湘、西瓜匠

新虫 (初入文坛)

[求助] 我pcr之后跑胶的条带模糊不清，但是能看出有条带，Marker也一样的？ 已有5人参与

如题，大家看下我的胶图，帮忙分析下原因。

我pcr之后跑胶的条带模糊不清，但是能看出有条带，Marker也一样的？


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木有西瓜的冬天~~~
1楼 2015-12-10 00:09:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Marker也跑成这样说明不仅是扩增产物的问题，而是电泳过程出问题了。
比如是否恒压或恒流？
电泳胶是否配制正确？
胶染还是泡染？如果泡染，是否时间太长？

PS：这样跑电泳有点浪费……
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3楼2015-12-10 09:02:41
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371522029

金虫 (正式写手)

小鱼儿
你這個pcr基本上是引物二聚体的感觉。我估计更电泳缓冲液体有关。最好是新的，胶片也要用缓冲液配置。另外上样也要特别的细心。电泳电压不要太大或者太小，注意恒压。

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4楼2015-12-10 09:09:19
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371522029

金虫 (正式写手)

小鱼儿

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那么小片段，需要总小的marker不要用原来嗯嗯大的。胶片浓度加大，2%的胶片试试。

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6楼2015-12-10 10:05:21
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普通回帖

樊雪1994

金虫 (小有名气)
染料少吧

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2楼2015-12-10 00:12:11
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潇湘、西瓜匠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 371522029 at 2015-12-10 09:09:19
你這個pcr基本上是引物二聚体的感觉。我估计更电泳缓冲液体有关。最好是新的，胶片也要用缓冲液配置。另外上样也要特别的细心。电泳电压不要太大或者太小，注意恒压。
...

我要的条带是114和91大小的，这个图片是先经过pcr，然后用了一种特异酶切，然后跑出来的，应该在100marker上下，然后就是最小面的条带不知道哪里来的，是引物二聚体？

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木有西瓜的冬天~~~
5楼2015-12-10 10:00:19
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潇湘、西瓜匠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lifechuteng at 2015-12-10 09:02:41
Marker也跑成这样说明不仅是扩增产物的问题，而是电泳过程出问题了。
比如是否恒压或恒流？
电泳胶是否配制正确？
胶染还是泡染？如果泡染，是否时间太长？

PS：这样跑电泳有点浪费……

因为要区分114和91两个条带，所以可以看到确实有大于100和小于100的，用的是90伏电压，跑了1个半小时，胶浓度2%，然后就这结果，模糊不清，胶都是新制的，在胶凝固刚溶好的时候加的染色剂，电泳液没换，会不会是电泳液？还是什么鬼？

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木有西瓜的冬天~~~
7楼2015-12-10 10:07:17
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 371522029 at 2015-12-10 09:09:19
你這個pcr基本上是引物二聚体的感觉。我估计更电泳缓冲液体有关。最好是新的，胶片也要用缓冲液配置。另外上样也要特别的细心。电泳电压不要太大或者太小，注意恒压。
...

你怎么知道这是引物二聚体？marker多大人家都没有标。
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8楼2015-12-10 11:03:38
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 潇湘、西瓜匠 at 2015-12-10 10:07:17
因为要区分114和91两个条带，所以可以看到确实有大于100和小于100的，用的是90伏电压，跑了1个半小时，胶浓度2%，然后就这结果，模糊不清，胶都是新制的，在胶凝固刚溶好的时候加的染色剂，电泳液没换，会不会是电 ...

114和91在琼脂胶上分出来没问题，但是并非跑得慢就一定跑得好，慢点跑一般只针对胖子，因为胖子跑快了容易掉队，于是就拖得一长串，比如跑个大几千bp的玩意。跑满的一个坏处就是扩散的问题，扩散是不可避免的，在电泳系统里面也就跟时间和温度相关，跑1个半小时，那得扩散成什么样。
你仍然用2%也行，提高点也行，然后电压提高，这跟你的电泳槽多宽有关系，跑个5V/cm的场强没问题。不是非常小的电泳槽，不纠结160V。
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9楼2015-12-10 11:10:51
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潇湘、西瓜匠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-12-10 11:03:38
你怎么知道这是引物二聚体？marker多大人家都没有标。...

最小的marker是100的

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木有西瓜的冬天~~~
10楼2015-12-10 12:11:21
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