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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PAGE胶回收的具体步骤
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xiaojo

新虫 (初入文坛)

[求助] PAGE胶回收的具体步骤

各位前辈，有没有人做过PAGE胶回收啊？我要回收甲基化的片段，已经从胶上挖了几十个条带了，放在1.5ml的离心管里，-20℃冰箱。现在要做回收了，有如下问题：
    1.PAGE的条带挖出来能放在-20℃冰箱吗？一般能存放多久？
    2.回收之后还要跑PCR，要使DNA溶解出来具体怎样处理？是加TE溶解再60℃水浴1小时吗？一般加多少TE合适？
    3.水浴后离心要取上清跑PCR，但是一般就是取几微升，那剩下的DNA要如何保存呢？
   还请各位前辈多多指点，这三伏天在实验室跑大板子不容易啊~
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1楼2012-07-20 10:29:27
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xiaojo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by tjhyf2012 at 2014-01-13 22:31:01
是啊，今天试了一下亚甲基蓝染色，但是效果不是很好，条带和背景分不太清楚，以后可以试试银染。请问银染之后的脱色步骤和蛋白电泳一样么？...

我没有做过蛋白电泳哎。把我银染的方法发给你，因为我做的是大板子，你的玻璃板要是小的话可以相应比例的减少量。
仪器和设备：
四个塑料方盒（比玻璃板面积稍大），2个2L的烧杯，摇床
试剂的准备：
固定液：200ml乙醇，10ml冰醋酸，加水至2L
染色液：4g AgNO3至2L蒸馏水中
显色液：把30g NaOH 溶于2L蒸馏水中，在使用前几分钟，加入终浓度为0.4%的甲醛溶液。
染色过程：
1.        固定：将附着凝胶的玻璃板放入固定液中，置于摇床上振荡约5min；
2.        染色：将玻璃板放入准备好的装有染色液的塑料盒中，放在摇床上振荡，染色8-12min；
3.        漂洗：将玻璃板放入蒸馏水中，漂洗1-2min,取出玻璃板，稍稍沥干；
4.        显色：在漂洗将要结束时，将20ml 37%甲醛加入准备好的NaOH溶液中，混匀后，将玻璃板置于显色液中，轻轻摇动，至条带完全清晰；
5.        晾干，拍照或者扫描保存。
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13楼2014-01-14 16:48:56
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-20 13:48:11
把条带切下来，加TE，尽量弄碎，下面三种方法选一种做
1.60℃水浴1h
2.4℃过夜
3.-20℃，4℃反复冻融三次，每次1h
PCR的时候取1μL作为模板。
te加入30ul就可以了，一般看你切胶的大小。
dna放te中就可以了。
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xiaojo
coasttocoast。
2楼2012-07-20 10:51:50
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xiaojo

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-20 10:51:50
把条带切下来，加TE，尽量弄碎，下面三种方法选一种做
1.60℃水浴1h
2.4℃过夜
3.-20℃，4℃反复冻融三次，每次1h
PCR的时候取1μL作为模板。
te加入30ul就可以了，一般看你切胶的大小。
dna放te中就可以了。

非常感谢啊！！
我还有个疑问啊。就是用TE溶解胶之后，离心，是把上清都取出来，转移到新的离心管里吗？剩下的胶就可以扔了是吗？还是可以取胶的一部分用来溶解，剩下的可以保存。一般胶放-20℃能放置多久啊？
我的问题有点多，呵呵~~
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3楼2012-07-20 11:00:57
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以上网去查一下这篇文献：一种从聚丙烯酰胺凝胶上回收DNA片段的简易方法，对你可能会有帮助的
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xiaojo
4楼2012-07-20 11:17:51
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ranger04

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-20 13:48:24
分子克隆3上有详细的protocol。简答来说就是把胶切小（不能切碎。离心不下去）用（NH4）Ac溶液重悬，振荡过夜将DNA扩散出来，再用乙醇沉淀DNA。祝顺利
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xiaojo
5楼2012-07-20 11:18:34
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaojo at 2012-07-20 11:00:57
非常感谢啊！！
我还有个疑问啊。就是用TE溶解胶之后，离心，是把上清都取出来，转移到新的离心管里吗？剩下的胶就可以扔了是吗？还是可以取胶的一部分用来溶解，剩下的可以保存。一般胶放-20℃能放置多久啊？
我 ...

可以转移的，剩下的也冻存起来，以防万一吗。冻存起来放置的时间半年没问题。
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coasttocoast。
6楼2012-07-20 11:36:15
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xiaojo

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-20 11:17:51
你可以上网去查一下这篇文献：一种从聚丙烯酰胺凝胶上回收DNA片段的简易方法，对你可能会有帮助的

已经下载了这篇文献，真的很有帮助，谢谢啊！
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7楼2012-07-20 15:26:46
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xiaojo

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by ranger04 at 2012-07-20 11:18:34
分子克隆3上有详细的protocol。简答来说就是把胶切小（不能切碎。离心不下去）用（NH4）Ac溶液重悬，振荡过夜将DNA扩散出来，再用乙醇沉淀DNA。祝顺利

分子克隆实验指南第三版，我有呢，在哪页啊？我之前没找着呢。
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8楼2012-07-20 15:28:51
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xiaojo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-20 11:36:15
可以转移的，剩下的也冻存起来，以防万一吗。冻存起来放置的时间半年没问题。...

啊。那我就放心了，我还怕给冻坏了呢。呵呵，谢谢前辈！
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9楼2012-07-20 15:29:43
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tjhyf2012

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-20 10:51:50
把条带切下来，加TE，尽量弄碎，下面三种方法选一种做
1.60℃水浴1h
2.4℃过夜
3.-20℃，4℃反复冻融三次，每次1h
PCR的时候取1μL作为模板。
te加入30ul就可以了，一般看你切胶的大小。
dna放te中就可以了。

谢谢楼主，再请教一个问题，这个种回收方法，是用哪种染色可以呢？银染还是亚甲蓝染色？
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10楼2014-01-10 21:46:35
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