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1楼 2015-11-12 20:27:18

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鱼yao

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-12 21:49:32

可能是因为退火温度就是在52度左右，56、58度温度太高，所以条带不亮

人都一样

2楼2015-11-12 21:26:07

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mascotte

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楼主未说明模板是基因组DNA，质粒DNA，还是反转录cDNA，设计好的引物要和NCBI相应的DNA，mRNA数据库进行比对，质粒DNA要自己用软件去比对质粒序列（含插入序列）和引物序列的配合度。
如果是质粒DNA模板，可能是引物特异性不好，能P出两条带说明有非特异结合，建议重新设计。
反转录cDNA由于包含基因选择性剪切的各种isoform，可能会有多个PCR产物，看条带大小回收自己想要的带做TA克隆再测序。
重新设计引物时最好加长序列，使退火温度设置在56-60度。

5楼2015-11-13 04:59:21

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晞朔

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18273176704: 金币+3, ★★★很有帮助, 用二次pcr做出来了 2015-11-25 16:35:23

就做20ul体系，取5ul检测，剩下的可以作为模板进行二次PCR，试试看。

6楼2015-11-13 13:07:07

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zhangkaitwo

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1.PCR产物浓度不高 2.DNA已经降解

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11楼2015-11-13 19:05:57

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2楼: Originally posted by 鱼yao at 2015-11-12 21:26:07
可能是因为退火温度就是在52度左右，56、58度温度太高，所以条带不亮

不是温度问题。。同样的温度20ul亮，50ul不亮，后来重做20ul也不亮了。。

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3楼2015-11-12 21:44:15

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534720018

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要有图才好啊……

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4楼2015-11-12 22:04:25

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5楼: Originally posted by mascotte at 2015-11-13 04:59:21
楼主未说明模板是基因组DNA，质粒DNA，还是反转录cDNA，设计好的引物要和NCBI相应的DNA，mRNA数据库进行比对，质粒DNA要自己用软件去比对质粒序列（含插入序列）和引物序列的配合度。
如果是质粒DNA模板，可能是引 ...

这是重设的第四队引物了。。。模板是反转录的dna,关键是带不亮，第一次的结果。。再做就重复不出来额。。做的结果根本统计不出来到底什么问题。。比如第一次我加模板dna1ul是没稀释过得，，有两条带。。还亮点。第二次再同样的条件。。就没带了。。因为师兄用没稀释的dna做出来了。。到我这就不行了。。就是带不亮。。

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7楼2015-11-13 15:04:11

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6楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-11-13 13:07:07
就做20ul体系，取5ul检测，剩下的可以作为模板进行二次PCR，试试看。

就是将剩下的稀释50倍做模板是吗

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8楼2015-11-13 15:05:56

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4楼: Originally posted by 534720018 at 2015-11-12 22:04:25
要有图才好啊……

图太多。。已经不知道发哪个。。。p了不知道多少遍。。

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9楼2015-11-13 15:09:54

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fMssop

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你可以用PCR 产物当模板试试重新扩增，cDNA当模板比PCR产物要脆弱一些。用你师兄的产物，或者你自己的暗的PCR产物当模板，纯化一下，加50ng左右就够了。