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18273176704

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr有带,总是不亮,,,什么原因?? 已有7人参与

做得普通pcr
2xEasy  MIX     10ul
   引物1            1ul
  引物2             1ul
   模板DNA        1ul
         水             7ul
20ul  体系       做了温度梯度。。。50.52.54.56.58.       50.52.54.  都有两条带。。56.58   有一条可是太暗。。。
循环是35个
之前也做过。。20ul亮,,,50ul  就不亮。。。再重复20ul   又不一样了。。也是暗。。为什么有带就是不亮。。。请求大神们指教。。。
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鱼yao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-12 21:49:32
可能是因为退火温度就是在52度左右,56、58度温度太高,所以条带不亮
人都一样
2楼2015-11-12 21:26:07
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mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主未说明模板是基因组DNA,质粒DNA,还是反转录cDNA,设计好的引物要和NCBI相应的DNA,mRNA数据库进行比对,质粒DNA要自己用软件去比对质粒序列(含插入序列)和引物序列的配合度。
如果是质粒DNA模板,可能是引物特异性不好,能P出两条带说明有非特异结合,建议重新设计。
反转录cDNA由于包含基因选择性剪切的各种isoform,可能会有多个PCR产物,看条带大小回收自己想要的带做TA克隆再测序。
重新设计引物时最好加长序列,使退火温度设置在56-60度。
5楼2015-11-13 04:59:21
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
18273176704: 金币+3, ★★★很有帮助, 用二次pcr做出来了 2015-11-25 16:35:23
就做20ul体系,取5ul检测,剩下的可以作为模板进行二次PCR,试试看。
6楼2015-11-13 13:07:07
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zhangkaitwo

银虫 (初入文坛)

1.PCR产物浓度不高  2.DNA已经降解

发自小木虫Android客户端
11楼2015-11-13 19:05:57
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普通回帖

18273176704

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 鱼yao at 2015-11-12 21:26:07
可能是因为退火温度就是在52度左右,56、58度温度太高,所以条带不亮

不是温度问题。。同样的温度20ul亮,50ul不亮,后来重做20ul也不亮了。。
铭记那些不可回首。。。相信自己。。。
3楼2015-11-12 21:44:15
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534720018

至尊木虫 (著名写手)

4楼2015-11-12 22:04:25
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18273176704

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by mascotte at 2015-11-13 04:59:21
楼主未说明模板是基因组DNA,质粒DNA,还是反转录cDNA,设计好的引物要和NCBI相应的DNA,mRNA数据库进行比对,质粒DNA要自己用软件去比对质粒序列(含插入序列)和引物序列的配合度。
如果是质粒DNA模板,可能是引 ...

这是重设的第四队引物了。。。模板是反转录的dna,关键是带不亮,第一次的结果。。再做就重复不出来额。。做的结果根本统计不出来到底什么问题。。比如第一次我加模板dna1ul是没稀释过得,,有两条带。。还亮点 。第二次再同样的条件。。就没带了。。因为师兄用没稀释的dna做出来了。。到我这就不行了。。就是带不亮。。
铭记那些不可回首。。。相信自己。。。
7楼2015-11-13 15:04:11
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18273176704

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-11-13 13:07:07
就做20ul体系,取5ul检测,剩下的可以作为模板进行二次PCR,试试看。

就是将剩下的稀释50倍做模板是吗
铭记那些不可回首。。。相信自己。。。
8楼2015-11-13 15:05:56
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18273176704

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 534720018 at 2015-11-12 22:04:25
要有图才好啊……

图太多。。已经不知道发哪个。。。p了不知道多少遍。。
铭记那些不可回首。。。相信自己。。。
9楼2015-11-13 15:09:54
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fMssop

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你可以用PCR 产物当模板试试重新扩增,cDNA当模板比PCR产物要脆弱一些。用你师兄的产物,或者你自己的暗的PCR产物当模板,纯化一下,加50ng左右就够了。
10楼2015-11-13 19:02:48
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