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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr有带，总是不亮，，，什么原因？？
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18273176704

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr有带，总是不亮，，，什么原因？？ 已有7人参与

做得普通pcr
2xEasy  MIX     10ul
   引物1            1ul
  引物2             1ul
   模板DNA        1ul
         水             7ul
20ul  体系       做了温度梯度。。。50.52.54.56.58.       50.52.54.  都有两条带。。56.58   有一条可是太暗。。。
循环是35个
之前也做过。。20ul亮，，，50ul  就不亮。。。再重复20ul   又不一样了。。也是暗。。为什么有带就是不亮。。。请求大神们指教。。。
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铭记那些不可回首。。。相信自己。。。
1楼 2015-11-12 20:27:18
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mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主未说明模板是基因组DNA，质粒DNA，还是反转录cDNA，设计好的引物要和NCBI相应的DNA，mRNA数据库进行比对，质粒DNA要自己用软件去比对质粒序列（含插入序列）和引物序列的配合度。
如果是质粒DNA模板，可能是引物特异性不好，能P出两条带说明有非特异结合，建议重新设计。
反转录cDNA由于包含基因选择性剪切的各种isoform，可能会有多个PCR产物，看条带大小回收自己想要的带做TA克隆再测序。
重新设计引物时最好加长序列，使退火温度设置在56-60度。
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5楼2015-11-13 04:59:21
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鱼yao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-12 21:49:32
可能是因为退火温度就是在52度左右，56、58度温度太高，所以条带不亮
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人都一样
2楼2015-11-12 21:26:07
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18273176704

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鱼yao at 2015-11-12 21:26:07
可能是因为退火温度就是在52度左右，56、58度温度太高，所以条带不亮

不是温度问题。。同样的温度20ul亮，50ul不亮，后来重做20ul也不亮了。。
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铭记那些不可回首。。。相信自己。。。
3楼2015-11-12 21:44:15
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534720018

至尊木虫 (著名写手)
要有图才好啊……

发自小木虫IOS客户端
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4楼2015-11-12 22:04:25
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