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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 荧光定量PCR引物的选择
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sundan611

铁虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR引物的选择

植物细胞提取RNA反转后用自己设计的引物做PCR，准备摸好条件测序确定为目的基因后交给其他公司做荧光定量，
现在遇到的问题是：
1.扩增目的片段为100bp，总是有比100bp大的其他非特异片段干扰，我该如何优化条件？
2.我的样本有两种，一种是经过光照，另一种为不经光照，用同样的条件同样的引物扩增同一个基因，但是亮度却不一样，比如都是同一个基因，同一对儿引物结果他俩的退火温度却不太一致，一个样本退火温度为64度是条带很亮，而另个样本却在50多度条带很亮，64度反而不亮，这是正常的吗？如图左面数第五个孔就是光照样本64度扩增的，同样的条件左面数最后一个孔就是不经光照64度扩增的，条带就不亮，我做定量究竟应该选哪个温度呢？


3.另外我该选择什么样的PCR条件才能保证定量结果的准确性？比如条带单一，扩增的很亮？还是不需要很亮，只需要扩增出条带就可以了？

荧光定量PCR引物的选择
20150702-4.jpg
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1楼 2015-07-21 14:53:18
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sundan611

铁虫 (小有名气)
为什么没人回复呢？
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2楼2015-07-23 11:06:12
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