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荧光定量PCR引物的选择
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植物细胞提取RNA反转后用自己设计的引物做PCR，准备摸好条件测序确定为目的基因后交给其他公司做荧光定量， 现在遇到的问题是： 1.扩增目的片段为100bp，总是有比100bp大的其他非特异片段干扰，我该如何优化条件？ 2.我的样本有两种，一种是经过光照，另一种为不经光照，用同样的条件同样的引物扩增同一个基因，但是亮度却不一样，比如都是同一个基因，同一对儿引物结果他俩的退火温度却不太一致，一个样本退火温度为64度是条带很亮，而另个样本却在50多度条带很亮，64度反而不亮，这是正常的吗？如图左面数第五个孔就是光照样本64度扩增的，同样的条件左面数最后一个孔就是不经光照64度扩增的，条带就不亮，我做定量究竟应该选哪个温度呢？ 3.另外我该选择什么样的PCR条件才能保证定量结果的准确性？比如条带单一，扩增的很亮？还是不需要很亮，只需要扩增出条带就可以了？  20150702-4.jpg |
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