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新虫 (初入文坛)

[求助] pcr出来亮带了，但不是目的条带，什么原因。还可以送去测测序吗还是mark的问题啊 已有3人参与

普通pcr。2xEasy  Mix  混合做的。做了一个梯度，50.52.54.56.58.60.都单一亮带，但是我的目的条带在1300bp左右，单一亮带在1000以内。。这种情况可能是什么原因啊，新手请求大神们指导。。感谢。

pcr出来亮带了，但不是目的条带，什么原因。还可以送去测测序吗还是mark的问题啊
PCR11.02.jpg
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铭记那些不可回首。。。相信自己。。。
1楼 2015-11-03 19:50:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

陈爱中

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-03 23:03:10
marker看着有点糊啊，但是应该不是marker的问题，如果marker降解的的话应该是显示你的条带大于你的预期值。

这种情况我感觉可能是你的目标序列内部存在你的引物互补位点，建议你仔细检查一下。
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5楼2015-11-03 22:17:43
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)
的确可以测序看看 测序不贵 三四天出结果 能扩增出来单一条带 一般引物问题不会太大 如果说是引物可能和和内部序列匹配 那么多梯度温度扩增应该有的温度下出现两个条带 即使1300哪那个条带比较浅。建议测序后再分析原因，然后重新设计引物。

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8楼2015-11-04 08:31:40
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普通回帖

wcq吴超群

新虫 (小有名气)
会不会是引物的问题，引物有错？

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2楼2015-11-03 20:20:42
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18273176704

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wcq吴超群 at 2015-11-03 20:20:42
会不会是引物的问题，引物有错？

我是对比了几种鱼的同源序列，在保守片段设计的引物。。用prim设计的。
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3楼2015-11-03 21:27:48
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咖啡豆G

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-03 23:02:56
重新做个温度梯度试试，条带不对应该不是marker的问题，也不用送去测序吧，直到条带在目的大小附近了再测序吧
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4楼2015-11-03 21:45:42
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18273176704

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 陈爱中 at 2015-11-03 22:17:43
marker看着有点糊啊，但是应该不是marker的问题，如果marker降解的的话应该是显示你的条带大于你的预期值。

这种情况我感觉可能是你的目标序列内部存在你的引物互补位点，建议你仔细检查一下。

引物只有三个连续碱基互补，应该没问题吧，用primer设计的时候，打分挺好的。。。我应该怎么检查啊
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铭记那些不可回首。。。相信自己。。。
6楼2015-11-04 08:24:58
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18273176704

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 咖啡豆G at 2015-11-03 21:45:42
重新做个温度梯度试试，条带不对应该不是marker的问题，也不用送去测序吧，直到条带在目的大小附近了再测序吧

重新做了。。还是在750那目的片段，，，，好崩溃。。好不容易p出来，，又不是的，我们师兄说可以拿去测测看是什么。
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7楼2015-11-04 08:27:11
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zhaolu0713

新虫 (著名写手)
测序吧，有些马克实在是不敢恭维

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9楼2015-11-04 09:49:03
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18273176704

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by w_goodluck at 2015-11-04 08:31:40
的确可以测序看看 测序不贵 三四天出结果 能扩增出来单一条带 一般引物问题不会太大 如果说是引物可能和和内部序列匹配 那么多梯度温度扩增应该有的温度下出现两个条带 即使1300哪那个条带比较浅。建议测序后再分析 ...

这次的引物就是重新设计。刚回的啊。。。这基因快折磨死我了。之前设计了三队引物呢。之前就是也做了温度梯度。。可是一直是模糊条带要不就没带。。怎么增加循环数。改模板引物浓度都没用。。这次好不容条带亮了。又不是目的片段。。原因一直找不到。。
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10楼2015-11-04 09:51:42
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