应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR求助
271/3返回列表123下一页
查看: 2135  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)

[求助] PCR求助

要扩一个567的条带，之前已经有人尝试过很多条件，但都没扩出来，我在他们的基础上又做了很多次，最近有一次做出来，目标条带比较弱，引物二聚体很亮，因为只是想做个基因分型，所以对条带要求不是太高，就投入了正式试验，但是后来的结果非常不稳定，条带时有时无，向各位大侠请教！

20ul体系试剂量（ul）

ddH20  13.4
10X buffer   2
25mM MgCl2  1.2
10mM dNTPs  0.4
10 uM primer F1  0.4
10 uM primer R2   0.4
Taq (Promega)（5U/ul） 0.2

96°C 4min
95°C 45s
58℃ 45s 30cycles
72°C 45s
72°C 7min
下面一张是开始摸条件时候，条带比较弱，但还能看得见。

下面的是正式分型，就没做出来，重复了很多遍，有时有一两个，有时又没有，同样的模板，有时有有时又没有。

今天把循环加到35次，还是没有做出来。


[ Last edited by 超级小葵 on 2011-8-16 at 14:22 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2011-08-16 14:18:45
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kang1534

铁杆木虫 (著名写手)

默默的就好

【答案】应助回帖

超级小葵(金币+1): 2011-08-30 08:50:46
不懂顶楼主！！！
赞一下 回复此楼
2楼2011-08-16 14:32:03
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kang1534 at 2011-08-16 14:32:03:
不懂顶楼主！！！

3楼2011-08-16 14:33:02
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rioarsenal

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
超级小葵(金币+2): 谢谢，引物设计过两次了，目前想改变条件。 2011-08-16 17:19:55
dhd997(金币+2): good 2011-08-16 18:03:26
1、重新设计引物
2、模板要保证质量
3、如果只想要目的条带，可以考虑做巢式PCR
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-08-16 14:58:20
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

睡着了！

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

超级小葵(金币+1): 做过无数遍了，已经很小心，试剂也换过全新的。 2011-08-16 17:21:35
同意！注意不要污染了！过程中这点最重要！
赞一下 回复此楼
一分耕耘，一分收获！
5楼2011-08-16 15:26:43
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ever!

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

超级小葵(金币+1): 2011-08-26 23:51:05
注意污染问题，重新设计引物
赞一下 回复此楼
6楼2011-08-16 15:55:03
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
超级小葵(金币+5): 谢谢，我试试看。 2011-08-16 17:21:54
dhd997(金币+3): good 2011-08-16 18:03:41
由图可知：
1）目的条带比较单一，说明引物特异性还不错——建议降低退火温度用56℃看看能不能提高扩增效率。
2）引物二聚体这么亮，引物之间可能会存在互补——建议PCR反应中加点DMSO,或适当减少引物浓度和gCl2的量，如果还是不行只好重新设计引物啦！
3）PCR条带很弱，且每次还不稳定，这也是正常的，引物二聚体多降低了扩增效率——建议正确配制PCR反应体系！
祝实验顺利！
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2011-08-16 16:05:06
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by srlee at 2011-08-16 16:05:06:
由图可知：
1）目的条带比较单一，说明引物特异性还不错——建议降低退火温度用56℃看看能不能提高扩增效率。
2）引物二聚体这么亮，引物之间可能会存在互补——建议PCR反应中加点DMSO,或适当减少引物浓度和gCl ...

但是为什么有的能够扩出来，而有的不行，比如图中的第一个，几乎每次都能扩出来，但其它的就不稳定，时有时无。
赞一下 回复此楼
8楼2011-08-16 17:23:08
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-16 18:03:52
超级小葵(金币+1): 2011-09-01 11:00:37
把扩增片段的GC含量和引物的GC含量及Tm值传上来
赞一下(1人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2011-08-16 17:49:28
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-16 17:49:28:
把扩增片段的GC含量和引物的GC含量及Tm值传上来

不知道啊，我是个新手。。。
赞一下 回复此楼
10楼2011-08-17 09:10:21
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 超级小葵 的主题更新
271/3返回列表123下一页
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +55 医学老男孩 2026-08-13 123/6150 2026-08-19 23:44 by stan_et
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +13 kkkl_v 2026-08-19 13/650 2026-08-19 22:37 by 宝贝虫子
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +12 基诺咪客 2026-08-17 16/800 2026-08-19 22:04 by kk 的小木虫
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +4 yuleib84 2026-08-19 5/250 2026-08-19 19:52 by hhs666
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +10 yuleib84 2026-08-18 11/550 2026-08-19 07:30 by 羽毛枫f
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭