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超级小葵

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[求助] PCR求助

要扩一个567的条带,之前已经有人尝试过很多条件,但都没扩出来,我在他们的基础上又做了很多次,最近有一次做出来,目标条带比较弱,引物二聚体很亮,因为只是想做个基因分型,所以对条带要求不是太高,就投入了正式试验,但是后来的结果非常不稳定,条带时有时无,向各位大侠请教!

20ul体系试剂量(ul)

ddH20  13.4
10X buffer   2
25mM MgCl2  1.2
10mM dNTPs  0.4
10 uM primer F1  0.4
10 uM primer R2   0.4
Taq (Promega)(5U/ul) 0.2

96°C 4min
95°C 45s
58℃ 45s 30cycles
72°C 45s
72°C 7min
下面一张是开始摸条件时候,条带比较弱,但还能看得见。

下面的是正式分型,就没做出来,重复了很多遍,有时有一两个,有时又没有,同样的模板,有时有有时又没有。

今天把循环加到35次,还是没有做出来。


[ Last edited by 超级小葵 on 2011-8-16 at 14:22 ]
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kang1534

铁杆木虫 (著名写手)

默默的就好

【答案】应助回帖

超级小葵(金币+1): 2011-08-30 08:50:46
不懂顶楼主!!!
2楼2011-08-16 14:32:03
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超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kang1534 at 2011-08-16 14:32:03:
不懂顶楼主!!!

3楼2011-08-16 14:33:02
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rioarsenal

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
超级小葵(金币+2): 谢谢,引物设计过两次了,目前想改变条件。 2011-08-16 17:19:55
dhd997(金币+2): good 2011-08-16 18:03:26
1、重新设计引物
2、模板要保证质量
3、如果只想要目的条带,可以考虑做巢式PCR
4楼2011-08-16 14:58:20
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睡着了!

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

超级小葵(金币+1): 做过无数遍了,已经很小心,试剂也换过全新的。 2011-08-16 17:21:35
同意!注意不要污染了!过程中这点最重要!
一分耕耘,一分收获!
5楼2011-08-16 15:26:43
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ever!

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

超级小葵(金币+1): 2011-08-26 23:51:05
注意污染问题,重新设计引物
6楼2011-08-16 15:55:03
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
超级小葵(金币+5): 谢谢,我试试看。 2011-08-16 17:21:54
dhd997(金币+3): good 2011-08-16 18:03:41
由图可知:
1)目的条带比较单一,说明引物特异性还不错——建议降低退火温度用56℃看看能不能提高扩增效率。
2)引物二聚体这么亮,引物之间可能会存在互补——建议PCR反应中加点DMSO,或适当减少引物浓度和gCl2的量,如果还是不行只好重新设计引物啦!
3)PCR条带很弱,且每次还不稳定,这也是正常的,引物二聚体多降低了扩增效率——建议正确配制PCR反应体系!
祝实验顺利!
7楼2011-08-16 16:05:06
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超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)


引用回帖:
7楼: Originally posted by srlee at 2011-08-16 16:05:06:
由图可知:
1)目的条带比较单一,说明引物特异性还不错——建议降低退火温度用56℃看看能不能提高扩增效率。
2)引物二聚体这么亮,引物之间可能会存在互补——建议PCR反应中加点DMSO,或适当减少引物浓度和gCl ...

但是为什么有的能够扩出来,而有的不行,比如图中的第一个,几乎每次都能扩出来,但其它的就不稳定,时有时无。
8楼2011-08-16 17:23:08
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-16 18:03:52
超级小葵(金币+1): 2011-09-01 11:00:37
把扩增片段的GC含量和引物的GC含量及Tm值传上来
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2011-08-16 17:49:28
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超级小葵

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引用回帖:
9楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-16 17:49:28:
把扩增片段的GC含量和引物的GC含量及Tm值传上来

不知道啊,我是个新手。。。
10楼2011-08-17 09:10:21
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