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超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)

[求助] PCR求助

要扩一个567的条带，之前已经有人尝试过很多条件，但都没扩出来，我在他们的基础上又做了很多次，最近有一次做出来，目标条带比较弱，引物二聚体很亮，因为只是想做个基因分型，所以对条带要求不是太高，就投入了正式试验，但是后来的结果非常不稳定，条带时有时无，向各位大侠请教！

20ul体系试剂量（ul）

ddH20  13.4
10X buffer   2
25mM MgCl2  1.2
10mM dNTPs  0.4
10 uM primer F1  0.4
10 uM primer R2   0.4
Taq (Promega)（5U/ul） 0.2

96°C 4min
95°C 45s
58℃ 45s 30cycles
72°C 45s
72°C 7min
下面一张是开始摸条件时候，条带比较弱，但还能看得见。

下面的是正式分型，就没做出来，重复了很多遍，有时有一两个，有时又没有，同样的模板，有时有有时又没有。

今天把循环加到35次，还是没有做出来。


[ Last edited by 超级小葵 on 2011-8-16 at 14:22 ]
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1楼 2011-08-16 14:18:45
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kang1534

铁杆木虫 (著名写手)

默默的就好

【答案】应助回帖

超级小葵(金币+1): 2011-08-30 08:50:46
不懂顶楼主！！！
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2楼2011-08-16 14:32:03
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超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kang1534 at 2011-08-16 14:32:03:
不懂顶楼主！！！

3楼2011-08-16 14:33:02
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rioarsenal

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
超级小葵(金币+2): 谢谢，引物设计过两次了，目前想改变条件。 2011-08-16 17:19:55
dhd997(金币+2): good 2011-08-16 18:03:26
1、重新设计引物
2、模板要保证质量
3、如果只想要目的条带，可以考虑做巢式PCR
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4楼2011-08-16 14:58:20
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睡着了！

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

超级小葵(金币+1): 做过无数遍了，已经很小心，试剂也换过全新的。 2011-08-16 17:21:35
同意！注意不要污染了！过程中这点最重要！
赞一下 回复此楼
一分耕耘，一分收获！
5楼2011-08-16 15:26:43
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ever!

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

超级小葵(金币+1): 2011-08-26 23:51:05
注意污染问题，重新设计引物
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6楼2011-08-16 15:55:03
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
超级小葵(金币+5): 谢谢，我试试看。 2011-08-16 17:21:54
dhd997(金币+3): good 2011-08-16 18:03:41
由图可知：
1）目的条带比较单一，说明引物特异性还不错——建议降低退火温度用56℃看看能不能提高扩增效率。
2）引物二聚体这么亮，引物之间可能会存在互补——建议PCR反应中加点DMSO,或适当减少引物浓度和gCl2的量，如果还是不行只好重新设计引物啦！
3）PCR条带很弱，且每次还不稳定，这也是正常的，引物二聚体多降低了扩增效率——建议正确配制PCR反应体系！
祝实验顺利！
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7楼2011-08-16 16:05:06
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超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by srlee at 2011-08-16 16:05:06:
由图可知：
1）目的条带比较单一，说明引物特异性还不错——建议降低退火温度用56℃看看能不能提高扩增效率。
2）引物二聚体这么亮，引物之间可能会存在互补——建议PCR反应中加点DMSO,或适当减少引物浓度和gCl ...

但是为什么有的能够扩出来，而有的不行，比如图中的第一个，几乎每次都能扩出来，但其它的就不稳定，时有时无。
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8楼2011-08-16 17:23:08
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-16 18:03:52
超级小葵(金币+1): 2011-09-01 11:00:37
把扩增片段的GC含量和引物的GC含量及Tm值传上来
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2011-08-16 17:49:28
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超级小葵

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-16 17:49:28:
把扩增片段的GC含量和引物的GC含量及Tm值传上来

不知道啊，我是个新手。。。
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10楼2011-08-17 09:10:21
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