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超级小葵

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[求助] PCR求助

要扩一个567的条带，之前已经有人尝试过很多条件，但都没扩出来，我在他们的基础上又做了很多次，最近有一次做出来，目标条带比较弱，引物二聚体很亮，因为只是想做个基因分型，所以对条带要求不是太高，就投入了正式试验，但是后来的结果非常不稳定，条带时有时无，向各位大侠请教！

20ul体系试剂量（ul）

ddH20  13.4
10X buffer 2
25mM MgCl2  1.2
10mM dNTPs  0.4
10 uM primer F1  0.4
10 uM primer R2 0.4
Taq (Promega)（5U/ul） 0.2

96°C 4min
95°C 45s
58℃ 45s 30cycles
72°C 45s
72°C 7min
下面一张是开始摸条件时候，条带比较弱，但还能看得见。

下面的是正式分型，就没做出来，重复了很多遍，有时有一两个，有时又没有，同样的模板，有时有有时又没有。

今天把循环加到35次，还是没有做出来。

[ Last edited by 超级小葵 on 2011-8-16 at 14:22 ]

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1楼 2011-08-16 14:18:45

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超级小葵

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引用回帖:

7楼: Originally posted by srlee at 2011-08-16 16:05:06:
由图可知：
1）目的条带比较单一，说明引物特异性还不错——建议降低退火温度用56℃看看能不能提高扩增效率。
2）引物二聚体这么亮，引物之间可能会存在互补——建议PCR反应中加点DMSO,或适当减少引物浓度和gCl ...

但是为什么有的能够扩出来，而有的不行，比如图中的第一个，几乎每次都能扩出来，但其它的就不稳定，时有时无。