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【求助/交流】pcr、酶切问题，急！ 已有1人参与
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各位虫虫，紧急求助！ 构建重组质粒，做了半年多的实验，还是一点进展没有，最近又遇到一些新问题： 1。 pcr不稳定，或出现杂带或P不出来。我用的是高保真的酶，之前一段时间p出来都很稳定，(先配大的体系然后分装成25的体系去p)只有一特异性条带。但最近做的时候如果是配成大体系再分装就会p不出来（可以确定加的试剂和量绝对不错，与以前一样），只配25的就能p出来，不过条带有两条，一条很亮，这条亮的条带很近的下方可以看到另一条带，较弱，但是很特异，而且跟那个亮的大小差不了多少，这是为什么？ 2。 质粒双酶切跑胶，在比预期大小要小的位置出现拖尾现象，并且加样孔稍有残留，是什么原因？酶切时间是4个小时，体系是20，各加了1的酶。之前用这个体系相同时间酶切质粒都能得到大小符合要求的线性的结果，这次有所不同的是换了个提质粒的试剂盒，提的质粒量要比以前亮的多。是因为载体过多没有切完全还是因为质粒没提好、混有杂质？ 3。 pcr产物割胶回收以后酶切出现多条带，最亮的条带下有较弱的特异性条带，并且靠得很近，单靠marker也分辨不出来哪条才是目的条带。以前也是相同的条件只有一条条带的。操作中应该也不可能污染到其他的杂质。不知道为什么出现这种情况，望高手指教！ 做了这么久，突然出现这种问题，十分着急，求助！  |
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jhu132llh
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大洪
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+4):good！ 2010-11-16 22:53:52
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+4):good！ 2010-11-16 22:53:52
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1。 pcr不稳定，或出现杂带或P不出来。我用的是高保真的酶，之前一段时间p出来都很稳定，(先配大的体系然后分装成25的体系去p)只有一特异性条带。但最近做的时候如果是配成大体系再分装就会p不出来（可以确定加的试剂和量绝对不错，与以前一样），只配25的就能p出来，不过条带有两条，一条很亮，这条亮的条带很近的下方可以看到另一条带，较弱，但是很特异，而且跟那个亮的大小差不了多少，这是为什么？ 答：（1）什么大体系分到小体系PCR不出是不可能的，只有可能是你分装的过程中的试剂盒手法出现点问题，排查一下吧。 （2）那是影子带，常常出现，加入一定量的辅助剂有助于解决这个问题如BSA,Triton-X100，等等，具体可以查看《分子克隆实验指南》一书。 |
2楼2010-11-16 13:00:06