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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 巢式PCR
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firsky

金虫 (小有名气)

[求助] 巢式PCR

同学在做土壤细菌多样性的检测，进行巢式PCR。刚开始做的时候直接把引物稀释到100μM，50μL体系加1μL，做出来结果虽然电泳有杂带，但主带很清晰。后来把引物稀释到10μM，第一轮PCR（目的片段1500bp左右）电泳图显示主带比较亮，继续进行第二轮PCR(目的片段200bp左右)，就只能隐隐约约出来弥散条带。
    请教一下可能的原因及解决方法。
    上图：

第一轮PCR的电泳图，Marker 2μL,产物5μL。第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，加了1μL。



第二轮PCR的电泳图，加样量第一轮。后来又用第一轮PCR产物做了第二轮PCR，条带稍微亮一些了，但还是弥散状。
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1楼 2012-04-16 10:57:13
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sarah_lz

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励提供有意义的解决问题的方法 2012-04-16 13:57:37
firsky: 金币+3, ★有帮助, 多谢，现在已经验证出是第二轮的引物降解的问题 2012-04-16 20:25:45
首先，nestpcr最关键是引物
第一轮1500base的产物估计不包含你的目的片段，第一轮看不到条带的
建议用blast检查一下引物区域的特异性，建议重新设计引物，两次长度不用相差那么大

其次，第二轮pcr底物浓度太高
第一轮电泳看不到条带的情况下大概+0.1uL为底物
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2楼2012-04-16 12:05:43
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chibang1220

木虫 (著名写手)
我也遇到过，来看看
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人的差别在于业余时间
3楼2012-04-16 12:52:47
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firsky

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sarah_lz at 2012-04-16 12:05:43:
首先，nestpcr最关键是引物
第一轮1500base的产物估计不包含你的目的片段，第一轮看不到条带的
建议用blast检查一下引物区域的特异性，建议重新设计引物，两次长度不用相差那么大

其次，第二轮pcr底物浓度太 ...

这个用的是通用引物，走的比较通用的土壤微生物多样性检测的流程，所以引物应该没有问题吧。
今天上午把底物稀释了又做PCR，结果没有条带。
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4楼2012-04-16 13:58:37
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firsky

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chibang1220 at 2012-04-16 12:52:47:
我也遇到过，来看看

你的情况是什么原因造成的，怎么解决的呢？
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5楼2012-04-16 13:59:40
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sarah_lz

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by firsky at 2012-04-16 13:58:37:
这个用的是通用引物，走的比较通用的土壤微生物多样性检测的流程，所以引物应该没有问题吧。
今天上午把底物稀释了又做PCR，结果没有条带。

不太了解你的体系。。
我做nest只是从文库钓取基因的，但原理上我认为最关键还是引物，第一轮没问题就是第二轮
有可能的话做阳性对照试试
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6楼2012-04-17 08:13:11
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励应助，欢迎常来 2012-04-19 13:47:20
firsky: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-04-20 08:43:30
第一轮片段的特异性很重要吧，我最近也遇到类似问题，第一轮PCR产物不是很好，会严重影响到后续实验，我的还在摸索条件，我能给你的建议是：1、将第一轮PCR产物切胶回收，以去掉那些非特异性片段；2、第二轮PCR时，将第一轮PCR产物稀释10倍后再作为模板进行扩增，引物少加点，引物浓度一般是10μM, 25 μL体系中可尝试只加0.35μL引物。
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7楼2012-04-19 10:39:16
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-04-19 10:39:16
第一轮片段的特异性很重要吧，我最近也遇到类似问题，第一轮PCR产物不是很好，会严重影响到后续实验，我的还在摸索条件，我能给你的建议是：1、将第一轮PCR产物切胶回收，以去掉那些非特异性片段；2、第二轮PCR时， ...

您好，我做的巢式PCR第一轮什么东西都没有，还有没有必要做第二轮了？
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8楼2013-05-16 20:08:34
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ljx2ljx

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-04-19 10:39:16
第一轮片段的特异性很重要吧，我最近也遇到类似问题，第一轮PCR产物不是很好，会严重影响到后续实验，我的还在摸索条件，我能给你的建议是：1、将第一轮PCR产物切胶回收，以去掉那些非特异性片段；2、第二轮PCR时， ...

您好，问您个问题，我做巢式PCR第一轮啥东西也没有，还有没有必要做第二轮了？
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9楼2013-05-16 20:09:19
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
第一轮没有扩出来还怎么往下做呢
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10楼2013-05-17 08:31:42
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