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巢式PCR
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同学在做土壤细菌多样性的检测，进行巢式PCR。刚开始做的时候直接把引物稀释到100μM，50μL体系加1μL，做出来结果虽然电泳有杂带，但主带很清晰。后来把引物稀释到10μM，第一轮PCR（目的片段1500bp左右）电泳图显示主带比较亮，继续进行第二轮PCR(目的片段200bp左右)，就只能隐隐约约出来弥散条带。 请教一下可能的原因及解决方法。 上图：  第一轮PCR的电泳图，Marker 2μL,产物5μL。第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，加了1μL。  第二轮PCR的电泳图，加样量第一轮。后来又用第一轮PCR产物做了第二轮PCR，条带稍微亮一些了，但还是弥散状。 |
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| 第一轮片段的特异性很重要吧，我最近也遇到类似问题，第一轮PCR产物不是很好，会严重影响到后续实验，我的还在摸索条件，我能给你的建议是：1、将第一轮PCR产物切胶回收，以去掉那些非特异性片段；2、第二轮PCR时，将第一轮PCR产物稀释10倍后再作为模板进行扩增，引物少加点，引物浓度一般是10μM, 25 μL体系中可尝试只加0.35μL引物。 |
7楼2012-04-19 10:39:16
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