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诡异的overlap PCR实验现象，pcr后大片段消失了 已有2人参与
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小弟最近接了个重叠PCR的任务，要求是将一段85bp的片段，插入到目的基因序列中，整个基因大小2.4k，插入的位置大约在2000bp左右。采用重叠片段的方法，共设计了4轮PCR反应：第一轮反应将该85bp片段的60bp接到目的基因前半部分；第二轮反应将85bp片段后面的25bp接上；第三轮将目的基因的后半部分P出来，这里设计的overlap片段为26bp，TM值63度；第三轮overlap PCR将整个基因全长P出，整个基因两端引物TM值59度。 试验结果是：前三轮反应都正常，可是overlap PCR就是死活P不出。为此，我将overlap反应的前后两段pcr产物克隆，送公司程序。测序结果显示：85bp的插入序列已经连上，overlap反应两端需要重叠的26bp片段也对。整个pcr过程全程使用pfu高保真酶，overlap退火温度做了个41度，44度，47度，50度，53度，56度，59度梯度pcr，任然没有任何2.5k左右的大片段扩增，只在500bp左右的位置有条很亮的弥散带。 跟同事交流后，我做了一个实验，将overlap反应前后两个片段的模板量加到很大。先不加引物，梯度退火20个循环。然后，再加引物跑35个循环，最后所有的样品跑胶检测。接下来，诡异的事情就发生了：我那条2K左右的大片段消失了！只有500bp左右有条弥散的带。本来按照我的设想，即使我的overlap反应失败，我应该任然可以看到我的2k左右的大片段（overlap使用的模板量很大）才对，但是它消失了。大批量多次实验结果都是如此。 我曾怀疑是否我的片段形成了某种高级结构，被我的高保证酶的外切酶活性给切掉了；但我换了普通的taq实验结果依然如此。 最让我郁闷的是：我按照这套实验方案，一共需要做5个重叠PCR，分别插入5条不同的序列到这个目的基因中。其中3个成功了，overlap PCR过程都很顺利；就是这个85bp和另外一条89bp的序列，做overlap死活P不出来。2个多月了，求高手解决！小弟不胜感谢。 |
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