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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何插入40bp的小片段
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decloud

木虫 (著名写手)

[求助] 如何插入40bp的小片段 已有1人参与

分子牛人多,继续搬问题

大家貌似对大片断都很熟悉,我来个小的...

我要在一个外源基因(900bp)的片段后面插入一段40bp左右的linker(有方向要求),,有没有高招.怎么样在不动这个外源基因(其3'端末端是ApaI, 并且就这么一个)的情况下,插入小片段.
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适则存乙，劳则忙乙，
1楼 2012-03-25 04:19:40
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
嗯................
是否可以尝试融合PCR(Fusion-PCR)呢，偶也想学习，请高手继续盖楼
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Let God do with it as He wills
2楼2012-03-25 09:14:33
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shuishui007

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
40bp合成好了，加上需要的酶切位点，5'端为ApaI或其同尾酶，3'为你需要的合适酶。
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3楼2012-03-25 09:50:30
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核 2012-03-28 10:08:28
这么短的片度，利用PCR加入很方便的，一次最多两次PCR就能搞定。
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4楼2012-03-25 10:02:33
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decloud

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shuishui007 at 2012-03-24 13:50:30:
40bp合成好了，加上需要的酶切位点，5'端为ApaI或其同尾酶，3'为你需要的合适酶。

那个质粒里面含的外源基因的3'末端只有ApaI, 我合成的小片段，必须是5‘， 3’ 都是ApaI末端，才能导入到质粒里面啊。。而且我不想动那个外源基因。。
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适则存乙，劳则忙乙，
5楼2012-03-25 10:57:26
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
使用overlap extension PCR，很简单，不涉及酶切位点
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生活是面镜子~
6楼2012-03-25 15:34:55
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同楼上几位的建议，通过PCR方法引入。
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7楼2012-03-25 16:42:13
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decloud

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by to-be at 2012-03-24 19:34:55:
使用overlap extension PCR，很简单，不涉及酶切位点

就是为那个900bp的外援基因和40bp的linker  设计一个overlap primer?,然后一次p,两头延伸? 这个是要引入的linker,,
ggaggtggaggctccggaggtggaggctct
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适则存乙，劳则忙乙，
8楼2012-03-25 16:52:48
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-26 10:43:40
设计引物时overlap的区域有15bp即可。
1.900下游设计引物，包括15bplinker前面的序列；
2.设计linker上游引物，包括900后面的15bp；
3.用900上下游引物扩增；同时扩linker，或者合成；
4.再将产物混合摩尔比1:1做模板，用900上游和linker下游引物扩增，将他们串联起来。
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生活是面镜子~
9楼2012-03-25 21:06:14
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decloud

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-03-24 14:02:33:
这么短的片度，利用PCR加入很方便的，一次最多两次PCR就能搞定。

如果没有做过分子呢,也2次搞定?
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适则存乙，劳则忙乙，
10楼2012-03-26 03:06:56
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