24小时热门版块排行榜    

查看: 1381  |  回复: 12
本帖产生 1 个 BioEPI ,点击这里进行查看

jian520yi

木虫 (正式写手)

[求助] 一个合成的约40bp的片段怎么引入载体?

如题,我需要在载体中加入一个纯化标签,标签两边酶切位点和载体一样,但标签是合成的小片段,40bp,怎么做?就用合成片段来扩增吗? 麻烦高手指点!
回复此楼
成功源自于不断的努力和坚持
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
jian520yi(金币+4): 非常感谢! 2011-08-04 19:24:19
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利! 2011-08-05 19:25:26
你合成的是双链,还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段,然后和载体连接
2楼2011-08-04 19:08:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jian520yi

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-04 19:08:59:
你合成的是双链,还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段,然后和载体连接

我还是有很多地方感觉不清楚,比如合成约25bpy引物,后面是用类似PCR的方法使其扩增?那酶,DNTP什么的要怎么解决?这么小怎么纯化?连接也会比较难呀。
成功源自于不断的努力和坚持
3楼2011-08-05 09:39:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
jian520yi(金币+6): 谢谢 2011-08-05 10:58:04
adslye(金币+3): 鼓励交流~祝顺利! 2011-08-05 19:25:52
不要扩增直接退火啊,你合成的引物浓度很高的,不用PCR扩增的
4楼2011-08-05 10:26:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jian520yi

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-05 10:26:17:
不要扩增直接退火啊,你合成的引物浓度很高的,不用PCR扩增的

有没有这个具体方法的文献或文章,技术路线什么的?
成功源自于不断的努力和坚持
5楼2011-08-05 10:59:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
adslye(金币+3): 鼓励交流~祝顺利! 2011-08-05 19:26:12
1.如果你合成的是两条单链,那么直接退火后就可以连接载体了,不过我现在很怀疑你的酶切位点处的序列设计的是否正确。如果可以把两条序列和酶切位点的名字传上来吧
2.如果你合成的是双链DNA,请确定你的酶切位点两端的保护碱基是否够用,最后每端有3个以上,然后酶切后连载体
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2011-08-05 14:04:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jian520yi

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-05 14:04:38:
1.如果你合成的是两条单链,那么直接退火后就可以连接载体了,不过我现在很怀疑你的酶切位点处的序列设计的是否正确。如果可以把两条序列和酶切位点的名字传上来吧
2.如果你合成的是双链DNA,请确定你的酶切位点 ...

我直接不用保护碱基,就是用酶切位点直接连载体,否则酶切还要处理很麻烦!给我留个邮箱吧,好交流些!
成功源自于不断的努力和坚持
7楼2011-08-05 14:39:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2, BioEPI+1): 首次说明小片段链接,对新手很有参考意义!感谢您的分享,祝顺利! 2011-08-05 19:27:49
引用回帖:
5楼: Originally posted by jian520yi at 2011-08-05 10:59:14:
有没有这个具体方法的文献或文章,技术路线什么的?

技术路线很简单,引物回来稀释成100pmol/ul
两条各取2ul混匀成4ul,95度变性5min,慢退火(PCR 95度反应后直接停止关机,30分钟后拿出来放在室温)

连接体系就是4ul小片段+载体(能达到300ng最好)+T4bufffer&ligase
连接反应过夜~~

做了两次,一次是平端补平加酶切位点,一次是加his-tag,都成功了,只要小片段的酶切位点别设计错了就ok~
8楼2011-08-05 16:28:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by jian520yi at 2011-08-05 14:39:18:
我直接不用保护碱基,就是用酶切位点直接连载体,否则酶切还要处理很麻烦!给我留个邮箱吧,好交流些!

加我QQ吧:343641035
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2011-08-05 16:41:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

按8楼说的做绝对没问题
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
10楼2011-08-05 16:41:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jian520yi 的主题更新
信息提示
请填处理意见