应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 一个合成的约40bp的片段怎么引入载体？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
131/2返回列表12下一页
查看: 1508  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看

jian520yi

木虫 (正式写手)

[求助] 一个合成的约40bp的片段怎么引入载体？

如题，我需要在载体中加入一个纯化标签，标签两边酶切位点和载体一样，但标签是合成的小片段，40bp，怎么做？就用合成片段来扩增吗？ 麻烦高手指点！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
成功源自于不断的努力和坚持
1楼 2011-08-04 18:37:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
jian520yi(金币+4): 非常感谢！ 2011-08-04 19:24:19
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-05 19:25:26
你合成的是双链，还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段，然后和载体连接
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-08-04 19:08:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jian520yi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-04 19:08:59:
你合成的是双链，还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段，然后和载体连接

我还是有很多地方感觉不清楚，比如合成约25bpy引物，后面是用类似PCR的方法使其扩增？那酶，DNTP什么的要怎么解决？这么小怎么纯化？连接也会比较难呀。
赞一下 回复此楼
成功源自于不断的努力和坚持
3楼2011-08-05 09:39:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
jian520yi(金币+6): 谢谢 2011-08-05 10:58:04
adslye(金币+3): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-05 19:25:52
不要扩增直接退火啊，你合成的引物浓度很高的，不用PCR扩增的
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-08-05 10:26:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jian520yi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-05 10:26:17:
不要扩增直接退火啊，你合成的引物浓度很高的，不用PCR扩增的

有没有这个具体方法的文献或文章，技术路线什么的？
赞一下 回复此楼
成功源自于不断的努力和坚持
5楼2011-08-05 10:59:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
adslye(金币+3): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-05 19:26:12
1.如果你合成的是两条单链，那么直接退火后就可以连接载体了，不过我现在很怀疑你的酶切位点处的序列设计的是否正确。如果可以把两条序列和酶切位点的名字传上来吧
2.如果你合成的是双链DNA，请确定你的酶切位点两端的保护碱基是否够用，最后每端有3个以上，然后酶切后连载体
赞一下(1人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2011-08-05 14:04:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jian520yi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-05 14:04:38:
1.如果你合成的是两条单链，那么直接退火后就可以连接载体了，不过我现在很怀疑你的酶切位点处的序列设计的是否正确。如果可以把两条序列和酶切位点的名字传上来吧
2.如果你合成的是双链DNA，请确定你的酶切位点 ...

我直接不用保护碱基，就是用酶切位点直接连载体，否则酶切还要处理很麻烦！给我留个邮箱吧，好交流些！
赞一下 回复此楼
成功源自于不断的努力和坚持
7楼2011-08-05 14:39:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2, BioEPI+1): 首次说明小片段链接，对新手很有参考意义！感谢您的分享，祝顺利！ 2011-08-05 19:27:49
引用回帖:
5楼: Originally posted by jian520yi at 2011-08-05 10:59:14:
有没有这个具体方法的文献或文章，技术路线什么的？

技术路线很简单，引物回来稀释成100pmol/ul
两条各取2ul混匀成4ul，95度变性5min，慢退火（PCR 95度反应后直接停止关机，30分钟后拿出来放在室温）

连接体系就是4ul小片段＋载体（能达到300ng最好）＋T4bufffer&ligase
连接反应过夜～～

做了两次，一次是平端补平加酶切位点，一次是加his-tag，都成功了，只要小片段的酶切位点别设计错了就ok～
赞一下(2人) 回复此楼
8楼2011-08-05 16:28:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jian520yi at 2011-08-05 14:39:18:
我直接不用保护碱基，就是用酶切位点直接连载体，否则酶切还要处理很麻烦！给我留个邮箱吧，好交流些！

加我QQ吧：343641035
赞一下(1人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2011-08-05 16:41:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)
按8楼说的做绝对没问题
赞一下 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
10楼2011-08-05 16:41:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jian520yi 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 272分求调剂 +4 wangyile2233 2026-04-02 4/200 2026-04-05 22:21 by 286640313
[考研] 348求调剂 +6 wukira 2026-04-04 6/300 2026-04-05 18:11 by 猪会飞
[考研] 考研生物学考A区211，初试322，科目生化和生物综合，求调剂 +6 。。。54 2026-04-03 6/300 2026-04-05 14:54 by JOKER0401
[考研] 数一英一 347 人工智能国奖论文都有求调剂 +3 乌拉儿山脉 2026-03-30 7/350 2026-04-05 10:32 by zhq0425
[考研] 一志愿电子科技大学085600材料与化工 329分求调剂 +10 Naiko 2026-04-04 10/500 2026-04-05 09:40 by sam3303
[考研] 083200 333求调剂 +3 十二！！ 2026-04-04 3/150 2026-04-05 08:28 by barlinike
[考研] 306求调剂 +3 hyb上名工 2026-04-02 3/150 2026-04-04 18:12 by 热情沙漠
[考研] 求调剂，一志愿北京中医药大学 +3 小小达不溜 2026-04-02 3/150 2026-04-03 22:55 by 冲矢昴星团
[考研] 350一志愿北京航空航天大学08500材料科学与工程求调剂 +5 kjnasfss 2026-04-03 5/250 2026-04-03 22:29 by 无际的草原
[考研] 281求调剂 +10 aaawhy 2026-04-03 10/500 2026-04-03 21:42 by lbsjt
[考研] 282求调剂 +5 呼吸都是减肥 2026-03-31 5/250 2026-04-03 12:03 by 1753564080
[考研] 311求调剂一志愿合肥工业大学 +15 秋二十二 2026-03-30 15/750 2026-04-03 10:19 by linyelide
[考研] 一志愿陕西师范大学生物学317分 +5 1563日。 2026-04-02 5/250 2026-04-03 06:58 by ilovexiaobin
[考研] 085900土木水利336分求调剂 +4 Zhangjiangj 2026-03-31 6/300 2026-04-02 11:40 by 1753564080
[考研] 一志愿安徽大学计算机科学与技术学硕，331分求调剂 +5 蒋昌鹏qtj 2026-04-01 5/250 2026-04-02 08:10 by fxue1114
[考研] 材料专业调剂 +5 啦啦啦哭 2026-03-31 6/300 2026-04-01 16:48 by JourneyLucky
[考研] 267求调剂 +13 uiybh 2026-03-31 13/650 2026-04-01 10:25 by 探123
[考研] 0855机械初试280求调剂 +3 kazenotori 2026-03-31 3/150 2026-04-01 10:08 by JourneyLucky
[考研] 313求调剂 +6 卖个关子吧 2026-03-31 6/300 2026-03-31 10:58 by Jaylen.
[考研] 297 地理学070500 复试求调剂 +3 小圆圈圈ooo 2026-03-30 3/150 2026-03-30 21:05 by 余震yz
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭