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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 一个合成的约40bp的片段怎么引入载体？
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jian520yi

木虫 (正式写手)

[求助] 一个合成的约40bp的片段怎么引入载体？

如题，我需要在载体中加入一个纯化标签，标签两边酶切位点和载体一样，但标签是合成的小片段，40bp，怎么做？就用合成片段来扩增吗？ 麻烦高手指点！
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1楼 2011-08-04 18:37:29
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
jian520yi(金币+4): 非常感谢！ 2011-08-04 19:24:19
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-05 19:25:26
你合成的是双链，还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段，然后和载体连接
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2楼2011-08-04 19:08:59
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jian520yi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-04 19:08:59:
你合成的是双链，还是用两条引物退火而成
http://edu.muchong.com/attachment/9c/48/654839_1299721150_644.jpg
可以利用两个引物退火形成带粘端小片段，然后和载体连接

我还是有很多地方感觉不清楚，比如合成约25bpy引物，后面是用类似PCR的方法使其扩增？那酶，DNTP什么的要怎么解决？这么小怎么纯化？连接也会比较难呀。
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成功源自于不断的努力和坚持
3楼2011-08-05 09:39:26
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
jian520yi(金币+6): 谢谢 2011-08-05 10:58:04
adslye(金币+3): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-05 19:25:52
不要扩增直接退火啊，你合成的引物浓度很高的，不用PCR扩增的
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4楼2011-08-05 10:26:17
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jian520yi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-05 10:26:17:
不要扩增直接退火啊，你合成的引物浓度很高的，不用PCR扩增的

有没有这个具体方法的文献或文章，技术路线什么的？
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5楼2011-08-05 10:59:14
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
adslye(金币+3): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-05 19:26:12
1.如果你合成的是两条单链，那么直接退火后就可以连接载体了，不过我现在很怀疑你的酶切位点处的序列设计的是否正确。如果可以把两条序列和酶切位点的名字传上来吧
2.如果你合成的是双链DNA，请确定你的酶切位点两端的保护碱基是否够用，最后每端有3个以上，然后酶切后连载体
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
6楼2011-08-05 14:04:38
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jian520yi

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-05 14:04:38:
1.如果你合成的是两条单链，那么直接退火后就可以连接载体了，不过我现在很怀疑你的酶切位点处的序列设计的是否正确。如果可以把两条序列和酶切位点的名字传上来吧
2.如果你合成的是双链DNA，请确定你的酶切位点 ...

我直接不用保护碱基，就是用酶切位点直接连载体，否则酶切还要处理很麻烦！给我留个邮箱吧，好交流些！
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7楼2011-08-05 14:39:18
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2, BioEPI+1): 首次说明小片段链接，对新手很有参考意义！感谢您的分享，祝顺利！ 2011-08-05 19:27:49
引用回帖:
5楼: Originally posted by jian520yi at 2011-08-05 10:59:14:
有没有这个具体方法的文献或文章，技术路线什么的？

技术路线很简单，引物回来稀释成100pmol/ul
两条各取2ul混匀成4ul，95度变性5min，慢退火（PCR 95度反应后直接停止关机，30分钟后拿出来放在室温）

连接体系就是4ul小片段＋载体（能达到300ng最好）＋T4bufffer&ligase
连接反应过夜～～

做了两次，一次是平端补平加酶切位点，一次是加his-tag，都成功了，只要小片段的酶切位点别设计错了就ok～
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8楼2011-08-05 16:28:23
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jian520yi at 2011-08-05 14:39:18:
我直接不用保护碱基，就是用酶切位点直接连载体，否则酶切还要处理很麻烦！给我留个邮箱吧，好交流些！

加我QQ吧：343641035
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2011-08-05 16:41:03
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
按8楼说的做绝对没问题
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
10楼2011-08-05 16:41:50
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