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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 4个片段连接不上，做了两个月，急需帮助！
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鱼虾水中游

新虫 (初入文坛)

[求助] 4个片段连接不上，做了两个月，急需帮助！ 已有3人参与

4个片段连接，载体A为puc19，片段B为1.1kb，片段C为0.9kb，片段D为1.1kb。酶切时用NEB内切酶，胶回收后跑胶条带大小正确（如下图marker7000bp,5000,3000,2000,1000,,500bp）。用NEB的T4 DNA连接酶16℃过夜连接，体系为15ul，载体（50ng）：目的片段=1：4，转化用TOP10，做了两个月了就是连接不上，有哪位大侠给分析一下原因？多谢啦！

4个片段连接不上，做了两个月，急需帮助！
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梦想在心中，更在脚下！
1楼 2015-10-12 10:31:02
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赵鑫易

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体：目的片段这里目的比例换算摩尔比了没有
然后就是看图上片段不是很亮（和marker比）并且片段较大（1kb）可能浓度较低，切胶回收（如果是的话）可以考虑几管合在一起回收可以提高浓度。

实在不行建议使用无缝连接（个人觉得挺好用的）
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2楼2015-10-12 14:07:30
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鱼虾水中游

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 赵鑫易 at 2015-10-12 14:07:30
载体：目的片段这里目的比例换算摩尔比了没有
然后就是看图上片段不是很亮（和marker比）并且片段较大（1kb）可能浓度较低，切胶回收（如果是的话）可以考虑几管合在一起回收可以提高浓度。

实在不行建议使用无 ...

您好，我的目的片段换算摩尔比了，这个图片是切胶回收点样4ul的结果。您能告诉我您无缝连接用的哪一家的试剂盒嘛？谢谢!
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梦想在心中，更在脚下！
3楼2015-10-12 14:27:12
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赵鑫易

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 鱼虾水中游 at 2015-10-12 14:27:12
您好，我的目的片段换算摩尔比了，这个图片是切胶回收点样4ul的结果。您能告诉我您无缝连接用的哪一家的试剂盒嘛？谢谢!...

我用的是vazyme的ClonExpress® II One Step Cloning Kit

个人经验
质粒载体1ug20u体系酶切完后按照说明书上温度加热限制酶失活然后不纯化（浓度太低了），pcr产物纯化然后按说明书做，之前不知道为什么酶切连接搞不好，ta也搞不好，这个做好了3个。。。20u的质粒载体酶切，每次用3u现在还有剩的。。。
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4楼2015-10-13 12:59:06
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

4段连接的效率很低的，建议放大连接体系，或者进行2步实验。。。实在不行直接找公司帮你完成，一步到位。。
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学习再学习，努力再努力。
5楼2015-10-26 15:20:08
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seraphlx

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我做克隆一年多，连得是3K多的片段，经验就是片段浓度一定要高，看你4u浓度还是挺低的，酶切的话最好分步酶切。还有一点，以我个人经验，如果是出现奇葩结果或者连不出来，99%都是自己的问题。连接比不合适，引物不合适，操作不合适什么的都有可能
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6楼2015-12-21 14:42:29
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鱼虾水中游

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by seraphlx at 2015-12-21 14:42:29
我做克隆一年多，连得是3K多的片段，经验就是片段浓度一定要高，看你4u浓度还是挺低的，酶切的话最好分步酶切。还有一点，以我个人经验，如果是出现奇葩结果或者连不出来，99%都是自己的问题。连接比不合适，引物不 ...

谢谢
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梦想在心中，更在脚下！
7楼2016-04-25 16:05:08
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