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各位好，小弟近来在做质粒构建，遇到一些问题，请赐教~ 原始质粒是从菌液里提出来的pET-28a；目的片段2200左右，上下游引物5'端分别加的是Bamh I和Ecor I的酶切位点，然后也都加好了Neb那张表格的保护碱基，都加了3个保护碱基，PCR条带也都正确，并割胶回收。 然后，质粒和目的片段37度4h双酶切，酶切体系12ul DNA；2ul Buffer K；4.4ul ddH20；0.8ul Bamh I；0.8ul Ecor I，电泳如图1，最左面的是2000的Marker，最右面的是原始质粒。 接着割胶回收，如图2，取割胶回收6.5ul 目的片段和1.5ul 质粒，再加1ul buffer和1ul 连接酶，16度连接20个小时，然后就做转化，感受态效率还可以，明天过来，长了30个左右，晚上接菌，并且在抗生素的培养基里都长了。 但是今天提质粒又是没提出来，已经做了好几次了，这是为什么？试剂盒、限制酶和连接酶都是用的Takara的。 看了原始质粒pET-28a的Bamh I和Ecor I的酶切位点是紧挨着的，是不是不能双酶切？ 请不吝赐教，非常感谢~  双酶切产物.gif  双酶切割胶回收.gif |
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1.你筛选平板上长的转化子是压根没提出来质粒还是里面有质粒只不过是空载的？ 2.质粒上两个酶切位点挨着确实比一般的难切，但不是切不开，需要延长切割时间或者分步酶切。 3.从电泳图上看你的基因浓度远远不够。割胶回收后检测连条带都没了，一是你酶切的基因和载体太少，回收前得多切几管，其次你胶回收率太低，可以用PCR产物纯化代替割胶回收，最后纯化后的基因和载体最好要检测浓度，基因载体摩尔比不好自然影响连接效率 |
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