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ayouyiyi

新虫 (初入文坛)

[求助] 请帮忙分析一下,非常感谢~已有7人参与

各位好,小弟近来在做质粒构建,遇到一些问题,请赐教~
原始质粒是从菌液里提出来的pET-28a;目的片段2200左右,上下游引物5'端分别加的是Bamh I和Ecor I的酶切位点,然后也都加好了Neb那张表格的保护碱基,都加了3个保护碱基,PCR条带也都正确,并割胶回收。
然后,质粒和目的片段37度4h双酶切,酶切体系12ul DNA;2ul Buffer K;4.4ul ddH20;0.8ul Bamh I;0.8ul Ecor I,电泳如图1,最左面的是2000的Marker,最右面的是原始质粒。
接着割胶回收,如图2,取割胶回收6.5ul 目的片段和1.5ul 质粒,再加1ul buffer和1ul 连接酶,16度连接20个小时,然后就做转化,感受态效率还可以,明天过来,长了30个左右,晚上接菌,并且在抗生素的培养基里都长了。
但是今天提质粒又是没提出来,已经做了好几次了,这是为什么?试剂盒、限制酶和连接酶都是用的Takara的。
看了原始质粒pET-28a的Bamh I和Ecor I的酶切位点是紧挨着的,是不是不能双酶切?
请不吝赐教,非常感谢~

请帮忙分析一下,非常感谢~
双酶切产物.gif


请帮忙分析一下,非常感谢~-1
双酶切割胶回收.gif
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luwei13566

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yuzhiming

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ayouyiyi

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luwei13566

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ayouyiyi

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ayouyiyi

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luwei13566

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ayouyiyi

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llj4212008

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-08-04 14:13:28
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