| 查看: 2261 | 回复: 24 | ||
[求助]
请帮忙分析一下，非常感谢~ 已有7人参与
|
||
|
各位好，小弟近来在做质粒构建，遇到一些问题，请赐教~ 原始质粒是从菌液里提出来的pET-28a；目的片段2200左右，上下游引物5'端分别加的是Bamh I和Ecor I的酶切位点，然后也都加好了Neb那张表格的保护碱基，都加了3个保护碱基，PCR条带也都正确，并割胶回收。 然后，质粒和目的片段37度4h双酶切，酶切体系12ul DNA；2ul Buffer K；4.4ul ddH20；0.8ul Bamh I；0.8ul Ecor I，电泳如图1，最左面的是2000的Marker，最右面的是原始质粒。 接着割胶回收，如图2，取割胶回收6.5ul 目的片段和1.5ul 质粒，再加1ul buffer和1ul 连接酶，16度连接20个小时，然后就做转化，感受态效率还可以，明天过来，长了30个左右，晚上接菌，并且在抗生素的培养基里都长了。 但是今天提质粒又是没提出来，已经做了好几次了，这是为什么？试剂盒、限制酶和连接酶都是用的Takara的。 看了原始质粒pET-28a的Bamh I和Ecor I的酶切位点是紧挨着的，是不是不能双酶切？ 请不吝赐教，非常感谢~  双酶切产物.gif  双酶切割胶回收.gif |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有297人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请大家帮忙分析一下！第二次投稿，AE给reject，主编给major revision.
已经有13人回复
- 求各位大神帮忙解释一下审稿人的评论，小硕不太理解，非常感谢~~~
已经有7人回复
- 求丝网印刷的虫友们帮忙分析一下，非常感谢
已经有7人回复
- 本人谱图菜鸟，各位大神帮帮我解析一下是不是目标化合物，非常感谢！急
已经有11人回复
- 各位前辈，帮忙分析下，导师这样回复是什么意思，万分感激
已经有16人回复
- 请帮忙分析一下，该用什么材料，什么热处理方式
已经有11人回复
- 求助求助，急啊，请各位虫友帮忙翻一下评审的这句话，非常感谢
已经有4人回复
- 请有经验的哥哥姐姐帮忙看一下这段英文，非常感谢。
已经有6人回复
- 新手一枚，大家帮忙分析一下我的高效液相图谱。O(∩_∩)O谢谢
已经有8人回复
- 麻烦各位虫友帮忙解析一下 3.29 处是什么出峰，非常感谢~~
已经有11人回复
- 请帮忙分析下XRD数据，这两天软件出问题，只分析了一半。非常紧急！十分感谢！
已经有10人回复
- 想查看自己的账户和密码，帮忙分析一下这是什么情况？
已经有11人回复
- 请高手帮忙分析一下SiO2-Al2O3的TG-DTA曲线，非常感谢！
已经有7人回复
- 帮忙分析一下这几个响应面的图
已经有16人回复
- 这个GC太诡异了，大家帮忙分析下原因，感谢。。。
已经有21人回复
- 求大家帮忙分析下这个CV曲线吧
已经有10人回复
- 刚投就被拒稿，请高手帮忙分析一下
已经有18人回复
- 帮忙分析一下这个tafel曲线，急~~~谢谢！
已经有10人回复
- 帮忙分析一下PDMAEMA的TGA图
已经有3人回复
- synthetic metals 投稿，审稿意见， 请各位帮忙分析一下！
已经有6人回复
- 请帮忙分析一下，谢谢
已经有13人回复
- 【求助】帮忙分析下I-V曲线
已经有26人回复
- 【求助】请高手帮忙分析一下这张固化DSC曲线图，非常感谢
已经有18人回复
- 【求助】帮忙比较一下几种化合物氧化性强弱关系，非常感谢！
已经有3人回复
- 【求助】看不懂文章极图分析，请帮忙解释一下！(图片已能显示)
已经有12人回复
luwei13566
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 184 (高中生)
- 金币: 4351.4
- 散金: 97
- 红花: 35
- 帖子: 641
- 在线: 261.1小时
- 虫号: 2380655
- 注册: 2013-03-27
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
6楼2014-08-02 20:32:45
yuzhiming
捐助贵宾 (知名作家)
- MolEPI: 2
- 应助: 49 (小学生)
- 金币: 18071.4
- 散金: 4225
- 红花: 10
- 帖子: 7776
- 在线: 1218.1小时
- 虫号: 48471
- 注册: 2004-06-19
- 性别: GG
- 专业: 植物学研究的新技术、新方
2楼2014-08-02 14:27:25
3楼2014-08-02 15:53:34
luwei13566
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 184 (高中生)
- 金币: 4351.4
- 散金: 97
- 红花: 35
- 帖子: 641
- 在线: 261.1小时
- 虫号: 2380655
- 注册: 2013-03-27
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ayouyiyi(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-02 17:29:20
ayouyiyi: 金币+20, ★★★很有帮助 2014-08-02 20:14:42
感谢参与，应助指数 +1
ayouyiyi(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-02 17:29:20
ayouyiyi: 金币+20, ★★★很有帮助 2014-08-02 20:14:42
|
1.你筛选平板上长的转化子是压根没提出来质粒还是里面有质粒只不过是空载的？ 2.质粒上两个酶切位点挨着确实比一般的难切，但不是切不开，需要延长切割时间或者分步酶切。 3.从电泳图上看你的基因浓度远远不够。割胶回收后检测连条带都没了，一是你酶切的基因和载体太少，回收前得多切几管，其次你胶回收率太低，可以用PCR产物纯化代替割胶回收，最后纯化后的基因和载体最好要检测浓度，基因载体摩尔比不好自然影响连接效率 |
4楼2014-08-02 17:02:04
5楼2014-08-02 20:14:30
7楼2014-08-02 22:38:39
luwei13566
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 184 (高中生)
- 金币: 4351.4
- 散金: 97
- 红花: 35
- 帖子: 641
- 在线: 261.1小时
- 虫号: 2380655
- 注册: 2013-03-27
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
ayouyiyi8楼2014-08-02 23:38:34
9楼2014-08-03 12:33:42
10楼2014-08-03 22:16:57
