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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 小片段pcr求助
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laraine40

金虫 (小有名气)

[求助] 小片段pcr求助

有一段452bp的基因，从质粒上p。之前p下来了，克隆也构建好了，但是表达不太好，所以最近打算重新构建一个克隆。然后换了引物之后，再也p不下来了。然后试着用之前的引物把这段基因p下来回收后做模板，还是不行。三步法做不出来，换了两步法，还是没用。上游引物63度，下游引物69.3度，从65到55拉了8个温度梯度，都没有。杂带多，目的条带看不到。确定引物设计没问题。求大神指导
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1楼 2015-09-22 17:42:19
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
那这对引物在以前的质粒上P
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。
2楼2015-09-22 17:51:14
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反应链

新虫 (正式写手)
模板质粒降解了吧。

质粒上的片段最好P了。

有没有重新提取质粒？

想办法找个阳性对照吧。
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3楼2015-09-22 18:34:06
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laraine40

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2015-09-22 17:51:14
那这对引物在以前的质粒上P

p了，条带很亮，然后我回收了之后做模板，还是没p出来
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4楼2015-09-22 18:52:42
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laraine40

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 反应链 at 2015-09-22 18:34:06
模板质粒降解了吧。

质粒上的片段最好P了。

有没有重新提取质粒？

想办法找个阳性对照吧。

模板没问题呀，后来又用原来的引物p了一次，p的没问题，换到新的引物又不行了。我检查过了，新的引物设计没错
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5楼2015-09-22 18:54:19
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反应链

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-22 22:14:53
引用回帖:
5楼: Originally posted by laraine40 at 2015-09-22 18:54:19
模板没问题呀，后来又用原来的引物p了一次，p的没问题，换到新的引物又不行了。我检查过了，新的引物设计没错...

你做巢式PCR啊？有新引物的Primer_BLAST结果图吗？

依据单一单边原则，新引物引发问题的可能向较大。
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6楼2015-09-22 20:24:14
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by laraine40 at 2015-09-22 18:52:42
p了，条带很亮，然后我回收了之后做模板，还是没p出来...

用这对引物在以前质粒模板上P出来，连到T载体上，再用这对引物试试
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。
7楼2015-09-22 21:38:42
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laraine40

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 反应链 at 2015-09-22 20:24:14
你做巢式PCR啊？有新引物的Primer_BLAST结果图吗？

依据单一单边原则，新引物引发问题的可能向较大。...

不是巢式PCR，后来和老板讨论了发现还是引物设计出了问题。。谢谢。。
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8楼2015-09-25 20:36:46
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laraine40

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2015-09-22 21:38:42
用这对引物在以前质粒模板上P出来，连到T载体上，再用这对引物试试...

谢谢回复，后来发现是新的引物设计出了问题，重新设计了
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9楼2015-09-25 20:37:27
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jackyoung

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by laraine40 at 2015-09-25 20:37:27
谢谢回复，后来发现是新的引物设计出了问题，重新设计了...

我就说吧，总是以为不是问题，然而这么玄乎的事一般都是脑子短路在最关键的地方搞错了。

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CestLaVie
10楼2015-09-25 21:00:02
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