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xiaozhou9959

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有关PCR问题求助,谢谢。 已有3人参与

本人用菌体做模板P基因组中一段功能基因,开始采用退火温度50和52度,电泳都能出现目的大小条带,测序出现套峰。于是尝试提高退火温度以提高特异性,但扩增都失败了,再采用原来的条件也扩增不出目的片段,想请大家帮我分析一下原因(所用的酶,dNTP,buffer都是新的)。谢谢~~
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zhenpeng84

铜虫 (小有名气)


lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-14 16:36:22
o        检查模板和引物的用量。
o        增加循环次数和/或模板DNA的用量
2楼2010-05-14 16:35:16
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

xiaozhou9959(金币+3):谢谢~~ 2010-05-23 16:35:39
建议提基因组,以此为模板。
用菌体做模板有时候会出现菌裂解不开或不完全的状况。而且菌体洗涤过程中是否洗干净,培养基中残留的成分也会对PCR产生影响。还有就是检查一下水。
PCR过程要做阴性对照,便于查清原因。
祝顺利~~
我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
3楼2010-05-14 16:40:37
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xiaozhou9959

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by zhenpeng84 at 2010-05-14 16:35:16:
o        检查模板和引物的用量。
o        增加循环次数和/或模板DNA的用量

谢谢,模板绝对是纯的,其他条件是我探索了好长时间确定的,应该都没有问题。
4楼2010-05-23 16:31:54
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xiaozhou9959

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by bettyshan at 2010-05-14 16:40:37:
建议提基因组,以此为模板。
用菌体做模板有时候会出现菌裂解不开或不完全的状况。而且菌体洗涤过程中是否洗干净,培养基中残留的成分也会对PCR产生影响。还有就是检查一下水。
PCR过程要做阴性对照,便于查清原 ...

谢谢,我每次做实验都做了阴性对照,用菌体做模板我都洗了两次,感觉你提基因组的建议很好。
5楼2010-05-23 16:35:12
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