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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有关PCR问题求助，谢谢。
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xiaozhou9959

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有关PCR问题求助，谢谢。 已有3人参与

本人用菌体做模板P基因组中一段功能基因，开始采用退火温度50和52度，电泳都能出现目的大小条带，测序出现套峰。于是尝试提高退火温度以提高特异性，但扩增都失败了，再采用原来的条件也扩增不出目的片段，想请大家帮我分析一下原因（所用的酶，dNTP，buffer都是新的）。谢谢~~
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1楼 2010-05-14 16:13:01
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zhenpeng84

铜虫 (小有名气)
★
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-14 16:36:22
o        检查模板和引物的用量。
o        增加循环次数和/或模板DNA的用量
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2楼2010-05-14 16:35:16
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick
xiaozhou9959(金币+3):谢谢~~ 2010-05-23 16:35:39
建议提基因组，以此为模板。
用菌体做模板有时候会出现菌裂解不开或不完全的状况。而且菌体洗涤过程中是否洗干净，培养基中残留的成分也会对PCR产生影响。还有就是检查一下水。
PCR过程要做阴性对照，便于查清原因。
祝顺利~~
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我们都是芸芸众生的小人物，相遇相知，都是幸福！
3楼2010-05-14 16:40:37
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xiaozhou9959

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhenpeng84 at 2010-05-14 16:35:16:
o        检查模板和引物的用量。
o        增加循环次数和/或模板DNA的用量

谢谢，模板绝对是纯的，其他条件是我探索了好长时间确定的，应该都没有问题。
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4楼2010-05-23 16:31:54
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xiaozhou9959

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by bettyshan at 2010-05-14 16:40:37:
建议提基因组，以此为模板。
用菌体做模板有时候会出现菌裂解不开或不完全的状况。而且菌体洗涤过程中是否洗干净，培养基中残留的成分也会对PCR产生影响。还有就是检查一下水。
PCR过程要做阴性对照，便于查清原 ...

谢谢，我每次做实验都做了阴性对照，用菌体做模板我都洗了两次，感觉你提基因组的建议很好。
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5楼2010-05-23 16:35:12
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