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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » real-time PCR求助
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cai3110274

木虫 (职业作家)

[求助] real-time PCR求助

最近做real-time PCR，遇到一些问题 ，希望会的虫友帮忙解答一下
1. 标准曲线的R2大于0.999，但是曲线斜率偏小，扩增效率大于100%， 融解曲线情况良好 没有引物二聚体，这是为什么呢 ？
2. 还有就是在阴性对照中也会出现扩增，但都在CT大于35（目的片段CT在15~25之间），是不是因为这个扩增导致了 扩增效率的增大？该怎么去除呢？
3. 我看到有人说扩增效率在  90~110之间都可以接受，阴性对照在35循环后出现扩增可以忽略不计，不知道有什么参考文献可以给出吗？

希望知道的虫友可以不吝赐教，非常感谢！
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夫天地者万物之逆旅
1楼 2013-01-12 13:46:52
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
cai3110274: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2013-01-14 07:55:03
引用回帖:
7楼: Originally posted by cai3110274 at 2013-01-13 13:51:00
是真核细胞   基因组还未公布 ，引物是根据转录组测序得到的片段设计的。 融解温度 基本上都是符合的。  有什么办法可以去除阴性扩增吗？...

如果不能确定是否跨内含子，无法排除是否是基因组DNA干扰。我觉得可能是RNA做反转录时有痕量DNA残留，试试用DNase多消化一下RNA样品。
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8楼2013-01-13 14:11:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
cai3110274: 金币+10, ★★★很有帮助, 嗯 原来40循环 现在准备降到35试试看 呵呵 2013-01-15 10:29:33
引用回帖:
10楼: Originally posted by cai3110274 at 2013-01-14 07:54:18
再请问下  DNase消化的时候  RNA会降解吗   多少时间为合适呢？  我现在用的 TAKARA的 反转录试剂盒    42℃2min 。再次表示感谢。...

DNase要用RNase-free的，理论上消化过程中不会降解RNA。消化时间根据买的酶稍有些不同，时间和温度按照说明做就可以了。酶的作用效果也和样品中DNA含量有关。因为你的负对照有扩增，如果不是引物引起的话，可能是DNA消化时稍微欠缺，稍微延长一点就可以了。
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14楼2013-01-14 15:16:44
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872940890

铁虫 (小有名气)
★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2013-01-15 13:52:41
可能你的循环数有点多了 退火时间可以适当降低
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cai3110274
我知道我得继续努力！加油！
15楼2013-01-14 16:07:35
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普通回帖

cai3110274

木虫 (职业作家)
自己顶一下
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夫天地者万物之逆旅
2楼2013-01-12 13:47:48
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ccharlien

木虫 (正式写手)
上个图看看嘛
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3楼2013-01-12 16:01:38
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cai3110274

木虫 (职业作家)
上图片了  希望帮助一下

1.png  标准曲线一条



3.png  相对定量扩增曲线



2.png   标准曲线几个点的 融解曲线



4.png   相对定量时 样品的融解曲线
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夫天地者万物之逆旅
4楼2013-01-12 16:38:47
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cai3110274

木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-12 16:01:38
上个图看看嘛

上图了  那条标准曲线是差的 最多的一条 希望指导一下
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夫天地者万物之逆旅
5楼2013-01-12 16:39:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cai3110274: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-01-13 13:51:11
扩增效率大是因为有非特异产物影响CT读取，可能与你的负对照有扩增相关。你做的真核还是原核生物？引物设计是否跨越内含子？负对照扩增出的产物的熔解温度是否与目的片段相同？
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6楼2013-01-13 02:00:52
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cai3110274

木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-13 02:00:52
扩增效率大是因为有非特异产物影响CT读取，可能与你的负对照有扩增相关。你做的真核还是原核生物？引物设计是否跨越内含子？负对照扩增出的产物的熔解温度是否与目的片段相同？

是真核细胞   基因组还未公布 ，引物是根据转录组测序得到的片段设计的。 融解温度 基本上都是符合的。  有什么办法可以去除阴性扩增吗？
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夫天地者万物之逆旅
7楼2013-01-13 13:51:00
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reninhat

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道用的是谁家的PCR仪和管子啊
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9楼2013-01-13 17:12:29
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cai3110274

木虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-13 14:11:56
如果不能确定是否跨内含子，无法排除是否是基因组DNA干扰。我觉得可能是RNA做反转录时有痕量DNA残留，试试用DNase多消化一下RNA样品。...

再请问下  DNase消化的时候  RNA会降解吗   多少时间为合适呢？  我现在用的 TAKARA的 反转录试剂盒    42℃2min 。再次表示感谢。
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夫天地者万物之逆旅
10楼2013-01-14 07:54:18
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