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cai3110274

木虫 (职业作家)

[求助] real-time PCR求助

最近做real-time PCR,遇到一些问题 ,希望会的虫友帮忙解答一下
1. 标准曲线的R2大于0.999,但是曲线斜率偏小,扩增效率大于100%, 融解曲线情况良好 没有引物二聚体,这是为什么呢 ?
2. 还有就是在阴性对照中也会出现扩增,但都在CT大于35(目的片段CT在15~25之间),是不是因为这个扩增导致了 扩增效率的增大?该怎么去除呢?
3. 我看到有人说扩增效率在  90~110之间都可以接受,阴性对照在35循环后出现扩增可以忽略不计,不知道有什么参考文献可以给出吗?

希望知道的虫友可以不吝赐教,非常感谢!
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夫天地者万物之逆旅
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cai3110274

木虫 (职业作家)

上图片了  希望帮助一下

1.png  标准曲线一条



3.png  相对定量扩增曲线



2.png   标准曲线几个点的 融解曲线



4.png   相对定量时 样品的融解曲线

夫天地者万物之逆旅
4楼2013-01-12 16:38:47
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cai3110274

木虫 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-12 16:01:38
上个图看看嘛

上图了  那条标准曲线是差的 最多的一条 希望指导一下
夫天地者万物之逆旅
5楼2013-01-12 16:39:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cai3110274: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-01-13 13:51:11
扩增效率大是因为有非特异产物影响CT读取,可能与你的负对照有扩增相关。你做的真核还是原核生物?引物设计是否跨越内含子?负对照扩增出的产物的熔解温度是否与目的片段相同?
6楼2013-01-13 02:00:52
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cai3110274

木虫 (职业作家)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-13 02:00:52
扩增效率大是因为有非特异产物影响CT读取,可能与你的负对照有扩增相关。你做的真核还是原核生物?引物设计是否跨越内含子?负对照扩增出的产物的熔解温度是否与目的片段相同?

是真核细胞   基因组还未公布 ,引物是根据转录组测序得到的片段设计的。 融解温度 基本上都是符合的。  有什么办法可以去除阴性扩增吗?
夫天地者万物之逆旅
7楼2013-01-13 13:51:00
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