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白色蜻蜓飞

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组DNA中关于载体去磷酸化的问题, 已有2人参与

实验一直卡在连接的问题上,选用的载体为老师以前自己构建的,所以每次载体双酶切后要去磷酸化,用的是takera的CIAP,按照步骤写的是爽酶切后加入去磷酸化体系,温育30min后加入终止液,然后在加热终止后切胶回收,可是胶片图中双酶切都是正常的条带也在,但是在加入CIAP后跑的胶线性化的载体就不见了。求助各位大神在载体去磷酸化的时候都是怎么做的。。

重组DNA中关于载体去磷酸化的问题,
双酶切1`W.png


重组DNA中关于载体去磷酸化的问题,-1
去磷酸化.png
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-07-10 21:04:59
我们一般单酶切,胶回收,然后再去磷酸化,直接纯化,就可以连接了。你的图没条带了,可能是胶回收的问题,不是去磷酸化的问题 。还有双酶切为什么还要去磷酸化那?应该是目的片段单酶切,在去磷酸化吧。
采菊东篱下,悠然见南山。
2楼2015-07-10 17:27:25
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
双酶切去磷酸化,可能是为了防止酶切不完全产生的单酶切片段而设计的。

让你老师换几个酶吧,感觉这两个酶效果不好。要么是你质粒提取有问题,要么是你酶切时候星号活性太大。
初来乍到,请多指教
3楼2015-07-10 23:29:18
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