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白色蜻蜓飞

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组DNA中关于载体去磷酸化的问题， 已有2人参与

实验一直卡在连接的问题上，选用的载体为老师以前自己构建的，所以每次载体双酶切后要去磷酸化，用的是takera的CIAP，按照步骤写的是爽酶切后加入去磷酸化体系，温育30min后加入终止液，然后在加热终止后切胶回收，可是胶片图中双酶切都是正常的条带也在，但是在加入CIAP后跑的胶线性化的载体就不见了。求助各位大神在载体去磷酸化的时候都是怎么做的。。

重组DNA中关于载体去磷酸化的问题，
双酶切1`W.png


重组DNA中关于载体去磷酸化的问题，-1
去磷酸化.png
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1楼 2015-07-10 17:15:16
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-07-10 21:04:59
我们一般单酶切，胶回收，然后再去磷酸化，直接纯化，就可以连接了。你的图没条带了，可能是胶回收的问题，不是去磷酸化的问题 。还有双酶切为什么还要去磷酸化那？应该是目的片段单酶切，在去磷酸化吧。
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采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2015-07-10 17:27:25
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
双酶切去磷酸化，可能是为了防止酶切不完全产生的单酶切片段而设计的。

让你老师换几个酶吧，感觉这两个酶效果不好。要么是你质粒提取有问题，要么是你酶切时候星号活性太大。
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初来乍到，请多指教
3楼2015-07-10 23:29:18
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