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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 30bp的DNA片段与3.5kb的载体连接
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zhuzhubaobei

新虫 (初入文坛)

[求助] 30bp的DNA片段与3.5kb的载体连接

求帮助：我想从公司直接合成两个30bp的引物，二者互补可以形成粘性末端，二者杂交形成双链后与酶切后的3.5kb载体连接。有以下几个问题：1. 引物设计时需要什么修饰，是不是5‘磷酸化？ 2.两个单链如何退火形成双链？多谢！
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1楼 2013-07-11 10:34:37
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回帖置顶 ( 共有1个 )

huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-17 17:37:54
gyesang: 回帖置顶 2013-07-17 17:37:59
zhuzhubaobei: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-16 15:56:21
LZ的方法理论上是可行的，但克隆的片段只有30bp，其实可以设计成引物，直接用重叠延伸PCR与载体连在一起。估计会方便一点。
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5楼2013-07-17 16:47:31
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-07-11 13:36:41
没有做过你说过的30个bp的克隆。
楼主的思路理论上可行，但是没有做过，楼主可以尝试一下，然后再来说说结果。
针对楼主问题：
1、5‘端磷酸化，没有太大必要。没有磷酸化可能链接效率会略低点。
2、退火温度，我建议是进行梯度退火，且退火梯度要小点，不能太大，以防错配。
说到错配，不知道30bp的引物错配是否严重？引物二聚体和发卡结构等是否严重？这些均是影响最后双链DNA的形成因素。
另外一条思路是，设计一条长的引物（含30bp目标序列+载体序列+酶切位点+保护碱基）和一条短的引物（针对载体序列），扩增出含有目标序列和载体序列的片段，再来进行克隆。
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2楼2013-07-11 13:13:33
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jasco

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
方案可行的，不用磷酸化，退火的时候可以用退火buffer，提高效率
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4楼2013-07-12 14:53:51
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
zhuzhubaobei(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 11:51:53
直接合成普通引物就可以，不需磷酸化。引物稀释到10uM后，各取1uL混合，加入NaCl溶液和水，使终体积为20uL。NaCl终浓度为50mM。
80度5min，自然降温退火。直接取适量用于连接。百试百灵。
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8楼2013-07-19 17:39:15
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普通回帖

zhuzhubaobei

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-07-11 13:13:33
没有做过你说过的30个bp的克隆。
楼主的思路理论上可行，但是没有做过，楼主可以尝试一下，然后再来说说结果。
针对楼主问题：
1、5‘端磷酸化，没有太大必要。没有磷酸化可能链接效率会略低点。
2、退火温度， ...

谢谢你的建议~  我过几天就试试，看什么结果。
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3楼2013-07-11 14:20:01
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zhuzhubaobei

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 16:47:31
LZ的方法理论上是可行的，但克隆的片段只有30bp，其实可以设计成引物，直接用重叠延伸PCR与载体连在一起。估计会方便一点。

这个方法不错，我试试
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6楼2013-07-19 16:31:47
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zhuzhubaobei

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-07-11 13:13:33
没有做过你说过的30个bp的克隆。
楼主的思路理论上可行，但是没有做过，楼主可以尝试一下，然后再来说说结果。
针对楼主问题：
1、5‘端磷酸化，没有太大必要。没有磷酸化可能链接效率会略低点。
2、退火温度， ...

还有个问题，上次说的磷酸化的问题。如果5‘端不磷酸化，那公司合成的时候默认的不是羟基-OH吗？ 这样的话片段如何与载体连上？
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7楼2013-07-19 16:34:13
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zhouking8758

木虫 (正式写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 11:52:27
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhuzhubaobei at 2013-07-19 16:34:13
还有个问题，上次说的磷酸化的问题。如果5‘端不磷酸化，那公司合成的时候默认的不是羟基-OH吗？ 这样的话片段如何与载体连上？...

这个我不知道5‘不磷酸化是否是羟基，连接酶对于没有磷酸化的片段也一样能够修复gap的。
就像如果我们做平端克隆的时候，对载体和片段都是要去磷酸化以降低自连的发生。
所以，这个问题你不用担心
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9楼2013-07-19 22:19:25
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baiyangnjau

木虫 (正式写手)
请问楼主这种方法成功了吗？最近也要插入30bp片段进入约4K的载体中
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努力成为自己想成为的人吧！
10楼2014-09-17 13:48:55
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