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zhuzhubaobei新虫 (初入文坛)
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30bp的DNA片段与3.5kb的载体连接
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| 求帮助：我想从公司直接合成两个30bp的引物，二者互补可以形成粘性末端，二者杂交形成双链后与酶切后的3.5kb载体连接。有以下几个问题：1. 引物设计时需要什么修饰，是不是5‘磷酸化？ 2.两个单链如何退火形成双链？多谢！ |
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8楼2013-07-19 17:39:15
zhouking8758
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【答案】应助回帖
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-07-11 13:36:41
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-07-11 13:36:41
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没有做过你说过的30个bp的克隆。 楼主的思路理论上可行，但是没有做过，楼主可以尝试一下，然后再来说说结果。 针对楼主问题： 1、5‘端磷酸化，没有太大必要。没有磷酸化可能链接效率会略低点。 2、退火温度，我建议是进行梯度退火，且退火梯度要小点，不能太大，以防错配。 说到错配，不知道30bp的引物错配是否严重？引物二聚体和发卡结构等是否严重？这些均是影响最后双链DNA的形成因素。 另外一条思路是，设计一条长的引物（含30bp目标序列+载体序列+酶切位点+保护碱基）和一条短的引物（针对载体序列），扩增出含有目标序列和载体序列的片段，再来进行克隆。 |
2楼2013-07-11 13:13:33
zhuzhubaobei
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3楼2013-07-11 14:20:01
jasco
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4楼2013-07-12 14:53:51