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徐官冲123

新虫 (小有名气)

[求助] 求长片段pcr扩增大神!!!!! 已有11人参与

本人最近在扩增长片段pcr,目的片段是7445bp,扩增原理:先用两对兼并引物各扩增出1000bp左右的片段,在根据这两个片段设计特异性引物扩增。但是设计了好几对特异性引物都没有扩出长片段,新手不知道是模板浓度不够?基因组DNA浓度是260ng/ul,还是引物不够长?现在是25bp,是否需要添加甜菜碱等类的物质?新手头一回做这个,师哥没有做过并且已经毕业了,老师对这个也不太懂,周围同学也没做过这么长的片段,跪求大神指导,顺道给个建议,感激不尽
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
直接用长片段PCR扩增试剂盒就可以了,扩增片段20 kb都能扩增出来,又不贵
rainwater
2楼2015-07-02 16:37:28
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
takara的LA预混酶就是扩大片段的

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-07-02 17:10:16
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
考虑这么多,直接用长片段PCRLA Taq DNA聚合酶试剂盒就行了,简单模板可以扩增三十几kb,基因组也可以扩增20kb的啊,,,你的酶没用对吧
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-07-02 17:15:36
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

内容已删除
5楼2015-07-02 18:40:13
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2015-07-02 16:37:28
直接用长片段PCR扩增试剂盒就可以了,扩增片段20 kb都能扩增出来,又不贵

用的Takara的LA Taq DNA的试剂盒,但是换了几次引物都没有扩出来,是不是需要把引物设计到35个bp左右哈?
6楼2015-07-02 18:44:35
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-07-02 17:10:16
takara的LA预混酶就是扩大片段的

我用的就是这个酶,但是扩了好几回都没出带,引物也换过,自己也想不明白问题出在哪,现在就想听一下大神的建议
7楼2015-07-02 18:51:11
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freud1981213

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
徐官冲123: 金币+20, ★★★很有帮助 2015-07-03 13:26:10
首先,考虑你的要扩增的目的基因组质量,是否完整,有更多空间结构。其次你的引物特异性,是否在目的片段上不是特别好。最后,就是优化PCR方法。这么长的片段不难扩增的。
agoodstartingpoint
8楼2015-07-02 21:53:27
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BBMC-2012

木虫 (知名作家)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
分前段扩啊,很兹的哦

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2015-07-02 22:42:22
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baichi121234

禁虫 (职业作家)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

10楼2015-07-02 23:03:50
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