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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求长片段pcr扩增大神！！！！！
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

[求助] 求长片段pcr扩增大神！！！！！ 已有11人参与

本人最近在扩增长片段pcr，目的片段是7445bp，扩增原理：先用两对兼并引物各扩增出1000bp左右的片段，在根据这两个片段设计特异性引物扩增。但是设计了好几对特异性引物都没有扩出长片段，新手不知道是模板浓度不够？基因组DNA浓度是260ng/ul，还是引物不够长？现在是25bp，是否需要添加甜菜碱等类的物质？新手头一回做这个，师哥没有做过并且已经毕业了，老师对这个也不太懂，周围同学也没做过这么长的片段，跪求大神指导，顺道给个建议，感激不尽
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1楼 2015-07-02 16:22:52
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接用长片段PCR扩增试剂盒就可以了，扩增片段20 kb都能扩增出来，又不贵
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rainwater
2楼2015-07-02 16:37:28
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
takara的LA预混酶就是扩大片段的

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3楼2015-07-02 17:10:16
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
考虑这么多，直接用长片段PCRLA Taq DNA聚合酶试剂盒就行了，简单模板可以扩增三十几kb，基因组也可以扩增20kb的啊，，，你的酶没用对吧
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-07-02 17:15:36
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
内容已删除
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5楼2015-07-02 18:40:13
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2015-07-02 16:37:28
直接用长片段PCR扩增试剂盒就可以了，扩增片段20 kb都能扩增出来，又不贵

用的Takara的LA Taq DNA的试剂盒，但是换了几次引物都没有扩出来，是不是需要把引物设计到35个bp左右哈？
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6楼2015-07-02 18:44:35
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 杨仔儿 at 2015-07-02 17:10:16
takara的LA预混酶就是扩大片段的

我用的就是这个酶，但是扩了好几回都没出带，引物也换过，自己也想不明白问题出在哪，现在就想听一下大神的建议
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7楼2015-07-02 18:51:11
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freud1981213

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
徐官冲123: 金币+20, ★★★很有帮助 2015-07-03 13:26:10
首先，考虑你的要扩增的目的基因组质量，是否完整，有更多空间结构。其次你的引物特异性，是否在目的片段上不是特别好。最后，就是优化PCR方法。这么长的片段不难扩增的。
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agoodstartingpoint
8楼2015-07-02 21:53:27
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BBMC-2012

木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分前段扩啊，很兹的哦

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9楼2015-07-02 22:42:22
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baichi121234

禁虫 (职业作家)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
10楼2015-07-02 23:03:50
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