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徐官冲123

新虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by baichi121234 at 2015-07-02 23:03:50
用那两对简并性引物重新组合下,试试能不能p出来

好,我试试
11楼2015-07-03 08:46:31
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 徐官冲123 at 2015-07-02 18:44:35
用的Takara的LA Taq DNA的试剂盒,但是换了几次引物都没有扩出来,是不是需要把引物设计到35个bp左右哈?...

你可以直接找他们技术支持,让他们帮你找一下原因。长片段引物需要长些,30-35 bp,Tm值在65-68℃。退火温度60-63℃。延伸时间长些。
rainwater
12楼2015-07-03 08:48:32
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by freud1981213 at 2015-07-02 21:53:27
首先,考虑你的要扩增的目的基因组质量,是否完整,有更多空间结构。其次你的引物特异性,是否在目的片段上不是特别好。最后,就是优化PCR方法。这么长的片段不难扩增的。

我也觉得不会太难,我在调整一下引物吧,优化pcr方法能具体说一下吗?谢谢
13楼2015-07-03 08:48:50
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易水秋寒

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1、你的目的片段不是很大,重新设计两端引物,直接使用LA Taq扩增目的片段,这样方法最简单也不难;
2、分段扩增,连接引物长度长一些,像你说的35bp-40bp,这样结合效果好一些。
14楼2015-07-03 09:13:05
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我是丫丫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.增加延伸时间,我扩增过4000多bp的
2.分段扩增
一颗自由的心不知是被身体束缚还是梦想
15楼2015-07-03 09:42:24
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by freud1981213 at 2015-07-02 21:53:27
首先,考虑你的要扩增的目的基因组质量,是否完整,有更多空间结构。其次你的引物特异性,是否在目的片段上不是特别好。最后,就是优化PCR方法。这么长的片段不难扩增的。

能讲一下具体如何优化PCR吗?什么是特别需要注意的?
16楼2015-07-03 13:24:19
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 徐官冲123 at 2015-07-02 18:51:11
我用的就是这个酶,但是扩了好几回都没出带,引物也换过,自己也想不明白问题出在哪,现在就想听一下大神的建议...

我也才开始,退货温度你换了吗,我换了7次才做出才。还延伸时间,等都换一下

[ 发自小木虫客户端 ]
17楼2015-07-03 15:48:25
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trizol11

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我扩长PCR的时候,直接买的宝生物LA taq酶,6800多。调整PCR程序后3次扩出来了,
引物我觉得有点短,再设计一个合成试试。不难扩,祝顺利!。
任重道远……
18楼2015-07-06 08:34:00
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以选择用高保真酶来扩增,LA也是可以的,不需要分段扩增,没有P出来的可能性很多,如果片段CG值过高,可以选择加5%DMSO试试,一般退火温度55度都能P出来。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
19楼2015-07-06 18:41:04
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by freud1981213 at 2015-07-02 21:53:27
首先,考虑你的要扩增的目的基因组质量,是否完整,有更多空间结构。其次你的引物特异性,是否在目的片段上不是特别好。最后,就是优化PCR方法。这么长的片段不难扩增的。

你克隆过大片段吗?能细说吗?怎么优化条件?拜托了
20楼2015-07-21 19:25:25
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