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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求长片段pcr扩增大神！！！！！
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by baichi121234 at 2015-07-02 23:03:50
用那两对简并性引物重新组合下，试试能不能p出来

好，我试试
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11楼2015-07-03 08:46:31
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 徐官冲123 at 2015-07-02 18:44:35
用的Takara的LA Taq DNA的试剂盒，但是换了几次引物都没有扩出来，是不是需要把引物设计到35个bp左右哈？...

你可以直接找他们技术支持，让他们帮你找一下原因。长片段引物需要长些，30-35 bp，Tm值在65-68℃。退火温度60-63℃。延伸时间长些。
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rainwater
12楼2015-07-03 08:48:32
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by freud1981213 at 2015-07-02 21:53:27
首先，考虑你的要扩增的目的基因组质量，是否完整，有更多空间结构。其次你的引物特异性，是否在目的片段上不是特别好。最后，就是优化PCR方法。这么长的片段不难扩增的。

我也觉得不会太难，我在调整一下引物吧，优化pcr方法能具体说一下吗？谢谢
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13楼2015-07-03 08:48:50
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易水秋寒

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、你的目的片段不是很大，重新设计两端引物，直接使用LA Taq扩增目的片段，这样方法最简单也不难；
2、分段扩增，连接引物长度长一些，像你说的35bp-40bp，这样结合效果好一些。
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14楼2015-07-03 09:13:05
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我是丫丫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.增加延伸时间，我扩增过4000多bp的
2.分段扩增
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一颗自由的心不知是被身体束缚还是梦想
15楼2015-07-03 09:42:24
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by freud1981213 at 2015-07-02 21:53:27
首先，考虑你的要扩增的目的基因组质量，是否完整，有更多空间结构。其次你的引物特异性，是否在目的片段上不是特别好。最后，就是优化PCR方法。这么长的片段不难扩增的。

能讲一下具体如何优化PCR吗？什么是特别需要注意的？
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16楼2015-07-03 13:24:19
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杨仔儿

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 徐官冲123 at 2015-07-02 18:51:11
我用的就是这个酶，但是扩了好几回都没出带，引物也换过，自己也想不明白问题出在哪，现在就想听一下大神的建议...

我也才开始，退货温度你换了吗，我换了7次才做出才。还延伸时间，等都换一下

[ 发自小木虫客户端 ]
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17楼2015-07-03 15:48:25
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trizol11

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我扩长PCR的时候，直接买的宝生物LA taq酶，6800多。调整PCR程序后3次扩出来了，
引物我觉得有点短，再设计一个合成试试。不难扩，祝顺利！。
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任重道远……
18楼2015-07-06 08:34:00
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以选择用高保真酶来扩增，LA也是可以的，不需要分段扩增，没有P出来的可能性很多，如果片段CG值过高，可以选择加5%DMSO试试，一般退火温度55度都能P出来。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
19楼2015-07-06 18:41:04
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徐官冲123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by freud1981213 at 2015-07-02 21:53:27
首先，考虑你的要扩增的目的基因组质量，是否完整，有更多空间结构。其次你的引物特异性，是否在目的片段上不是特别好。最后，就是优化PCR方法。这么长的片段不难扩增的。

你克隆过大片段吗？能细说吗？怎么优化条件？拜托了
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20楼2015-07-21 19:25:25
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