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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 请教一些关于蛋白纯化的～问题
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alexnoname

新虫 (初入文坛)

[交流] 请教一些关于蛋白纯化的～问题 已有3人参与

最近本人在延续师姐的菌株做蛋白下游纯化，遇到了一些比较奇怪的问题，新手没什么经验，所以想请教一下大家一些问题
1我的蛋白超声后用1.5ml离心管10000rpm离心10min，上清和沉淀都有蛋白是不是就可以确定一定有包含体也有可溶性表达？有没有可能上清中的蛋白是离心不完全呢？
2蛋白沉淀用8m尿素还是无法裂解正常么？
3用蛋白分析软件看我的蛋白疏水氨基酸指数挺高，且分布平均，会不会影响其亲水氨基酸电离导致预测软件对等电点预测与实际等电点不合？
4实验加入SDS 后完全溶解，老板想让我加入SDS继续做纯化过柱子，请问SDS是不是很难除去？会不会对离子柱纯化效果产生影响？
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1楼 2015-06-24 01:34:10
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andypotter

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看完之后的一点个人意见，仅供参考，不喜勿喷：
1、上清和沉淀中都有蛋白，我个人觉得可以估一个量么，就是看看蛋白大部分是在沉淀里还是上清中，一般包涵体表达的上清中都会有一些相应的蛋白可溶的。10000rpm 10min应该是能够完全离心的了。

2、8M尿素的溶解效果是不如6M盐酸胍的，因此有的包涵体蛋白是会用8M尿素溶解不好的，应该也是正常的

3、这个我就不太了解了

4、应该还是对过离子柱有些影响的，SDS会和蛋白结合带负电，这样的话纯化效果估计会不太好
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2楼2015-06-24 08:54:08
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1. 上清和沉淀都有目的蛋白是很常见的事啊，很多蛋白都会产生可溶性蛋白表达和包涵体，只是量多量少的问题。可以跑电泳看看，根据表达蛋白的量再确定是否需要做蛋白复性
2. Urea的溶解不行就用盐酸胍吧
3. 疏水氨基酸指数高对等电点没有影响，只会影响蛋白的可溶性
4. SDS在后期非常难除去，只能在低温下不断稀释，最后在透析使之不影响实验结果，但想完全除去很难
可以的话建议试试疏水柱纯化，应该会有比较好的效果
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
3楼2015-06-24 10:56:00
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1我的蛋白超声后用1.5ml离心管10000rpm离心10min，上清和沉淀都有蛋白是不是就可以确定一定有包含体也有可溶性表达？有没有可能上清中的蛋白是离心不完全呢？
答：不能。包涵体的形成和溶解都是动态的过程。

2蛋白沉淀用8m尿素还是无法裂解正常么？
答：很正常呀，因为沉淀颗粒大，变性剂只能够接触到颗粒表面的蛋白质，可以适当把沉淀杂碎些再用变性剂或者表面活性剂。Urea、盐酸胍、表面活性剂可轮换使用，还可以适当加热。楼主说的沉淀因该是包涵体吧。

3用蛋白分析软件看我的蛋白疏水氨基酸指数挺高，且分布平均，会不会影响其亲水氨基酸电离导致预测软件对等电点预测与实际等电点不合？
答：任何分析预测软件都有局限性，可以多用几种生物信息学软件加以等电点预测。顺便还可以做个蛋白质的空间结构预测。

4实验加入SDS 后完全溶解，老板想让我加入SDS继续做纯化过柱子，请问SDS是不是很难除去？会不会对离子柱纯化效果产生影响？
答：直接不除去SDS就用离子交换层析柱的效果不好，我们反正从来没有这样用做过，因为会屏蔽蛋白质的原有电荷，每1克蛋白质平均结合1.4克SDS，虽然过柱时SDS也会掉下来，但是肯定不会全部掉下来。
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4楼2015-06-24 11:32:15
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