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各位虫友能帮忙分析下我提取的果实RNA问题可能出在哪吗？ 已有9人参与
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操作步骤 1) 取 800ul 提取缓冲液加入 2ml 离心管中，预热至 65℃ 2) 取新鲜样品放入研钵，在液氮中迅速研磨成粉末状。 3) 迅速将 50-100mg 粉末状样品转入预热的提取缓冲液中， 涡旋振荡器混匀，65℃水浴 10min，每隔 2min 混匀一次。 4) 水浴结束后， 冷却至室温。 5) 向离心管中加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)， 涡旋振荡器充分混匀，冰浴10min。 6) 离心管在 4℃下 12000×g 离心 10min。 7) 取上清，转入新的 2ml 离心管，重复操作(5)、 (6)。注：如果中间层仍有物质，可以继续重复步骤（ 5）和（ 6），直至中间层较干净为止（但最多抽提 4 次，过柱时抽提 3 次，否组次数太多会降解）。 8) 取上清，转入新的 1.5ml 离心管中， 加入 1/3 体积的 8M LiCl，混匀，加入等体积的异丙醇，混匀， 放入-20℃冰箱1小时。 9) 4℃， 12000×g 离心 15 min。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。 10) 向 RNA 沉淀中加入 1ml 75％乙醇， 漩涡振荡器上振荡混匀 5s， 4oC， 7500×g离心 5min，弃上清。 11) 4oC， 7500×g 离心 1min，用枪头小心吸弃多余液体。 提取了很多次，效果都不好！恳请各位帮忙分析一下！图中间是mark，右边是实验提取的RNA。是不是RNA降解的太厉害？还是DNA降解所出现的拖尾现象？  IMG_2443.JPG |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小茶91520: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-06-17 16:36:38
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小茶91520: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-06-17 16:36:38
| 从图上看RNA明显降解了。不知道你的试剂是什么配方，植物中富含多酚和多糖，果实中多糖含量很高，用常用试剂通常效果不好，现在有很多文献，里面是一些改良方法，比如加入PVP除酚类物质，巯基乙醇防止氧化，licl是可以除多糖的，但是它在沉淀RNA的时候是选择性沉淀分子量大的RNA，一些低分子量的可能会丢失，你如果做小RNA，或tRNA类的研究最好不用此方法，可以用终浓度10%的乙醇离心去除多糖。多查查文献吧，我们提这一类的植物RNA都是自己配制的试剂，比试剂盒好一些。 |
14楼2015-06-17 15:39:15
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