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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » Trizol 法怎么提取高质量RNA
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fuchange918

木虫 (正式写手)

[求助] Trizol 法怎么提取高质量RNA 已有5人参与

本人实验真菌用Trizol法提取RNA后，跑胶验证降解程度还可以忍受，但是污染方面很严重：OD260/280=1.5左右，OD260/230=1.0左右，后期需要做RACE
主要有一下问题：
（1）试验中哪些试剂需要预冷（4度还是-20℃），比如氯仿、异丙醇、75%乙醇
（2）每次异丙醇沉淀离心后，管壁上总是粘有和底部沉淀一样的东西，而且沉淀用DEPC处理水溶解时总是不能全部溶解，应该怎么解决？
（3）还有就这这么步骤中的放置时间，帮我看看有没有问题，是过长还是过短
本人RNA提取步骤：
1、细胞或组织加 Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解。。
2、12,000rpm 离心 10min，弃沉淀。
3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，上下颠倒混匀后冰上放置5min。
4、4℃ 12,000g 离心 15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中
6、按 0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，冰浴放置10min。
7、4℃ 12,000g 离心 10min，弃上清，RNA 沉于管底。
8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g 离心 5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥 5-10min。注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用 30ul DEPC处理水溶解RNA样品
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1楼 2014-09-05 14:41:53
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-05 14:59:15
建议将后面的6-11步，更改为过柱法。
RNA专用纯化柱，获得RNA纯度更高，量会损失小许。
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有你真好
2楼2014-09-05 14:50:54
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fuchange918

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a314919473 at 2014-09-05 14:50:54
建议将后面的6-11步，更改为过柱法。
RNA专用纯化柱，获得RNA纯度更高，量会损失小许。

柱子法是不是很贵啊
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3楼2014-09-05 15:38:53
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-09-05 17:18:09
fuchange918: 金币+3, ★有帮助 2014-09-05 21:03:41
所需氯仿 乙醇 异丙醇常温即可。
离心的时候4度，其他操作常温也没有问题的。
第6步，一般还是加入等体积的异丙醇来沉淀。
“每次异丙醇沉淀离心后，管壁上总是粘有和底部沉淀一样的东西，”跟离心时不平衡有关。
污染严重的话，可能是样品量比较大，抽提不彻底，蛋白含量高吧。
提RNA的组织量不需要太大。
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Stop fighting,let it flow.
4楼2014-09-05 15:56:04
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-09-05 15:38:53
柱子法是不是很贵啊...

贵不贵要看你自己了，可以买便宜的例如生工的（一次大概10元），也可以买贵的例如QIAGEN的（一次大概70元），做RACE最好是用好一点的，我们也做这个服务的。仅供参考
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有你真好
5楼2014-09-05 15:58:24
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
fuchange918: 金币+2, ★有帮助 2014-09-05 21:03:13
价格跟质量有关系，便宜的生工（一次10几元），贵的QIAGEN（一次可能要70元以上）。做RACE做好用好的试剂。仅供参考
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有你真好
6楼2014-09-05 16:01:13
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zuoyly

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fuchange918: 金币+1, ★有帮助 2014-09-05 21:03:25
建议使用一个Vazyme公司的RNA isolater Total RNA Extraction Reagent试试，我使用的挺好的
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7楼2014-09-05 16:31:39
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fuchange918

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by a314919473 at 2014-09-05 16:01:13
价格跟质量有关系，便宜的生工（一次10几元），贵的QIAGEN（一次可能要70元以上）。做RACE做好用好的试剂。仅供参考

生工的 质量怎么样呢
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8楼2014-09-05 21:02:53
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xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fuchange918(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-06 22:57:26
产物不溶看起来好像是你的样品里面蛋白或者糖类的含量比较高,糖类多可以参考植物RNA的提取方法,用氯化铝溶液先沉淀一遍. 蛋白高的话用酚氯仿多过一遍. 需要提醒的是这样处理完纯度是高了,RNA的量相对也小一点.
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9楼2014-09-06 04:30:41
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fuchange918

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xipha at 2014-09-06 04:30:41
产物不溶看起来好像是你的样品里面蛋白或者糖类的含量比较高,糖类多可以参考植物RNA的提取方法,用氯化铝溶液先沉淀一遍. 蛋白高的话用酚氯仿多过一遍. 需要提醒的是这样处理完纯度是高了,RNA的量相对也小一点.

第二遍酚氯仿的量应该是多少呢
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10楼2014-09-06 08:10:54
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