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铁虫 (初入文坛)

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[交流] RNA提取TRIZOL法最关键的注意步骤是什么已有17人参与

因为本人提取RNA经常降解，所以想请教大家到底那一步是最容易造成RNA降解的哦

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1楼 2011-12-07 18:47:10

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国青lihe

铜虫 (正式写手)

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scelab(金币+5): 谢谢回复哦~ 2012-01-14 14:10:11

总RNA的提取（Trizol法提取）
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；
3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；
4. 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；
5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；
6. 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。