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fuchange918木虫 (正式写手)
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Trizol 法怎么提取高质量RNA 已有5人参与
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本人实验真菌用Trizol法提取RNA后，跑胶验证降解程度还可以忍受，但是污染方面很严重：OD260/280=1.5左右，OD260/230=1.0左右，后期需要做RACE 主要有一下问题： （1）试验中哪些试剂需要预冷（4度还是-20℃），比如氯仿、异丙醇、75%乙醇 （2）每次异丙醇沉淀离心后，管壁上总是粘有和底部沉淀一样的东西，而且沉淀用DEPC处理水溶解时总是不能全部溶解，应该怎么解决？ （3）还有就这这么步骤中的放置时间，帮我看看有没有问题，是过长还是过短 本人RNA提取步骤： 1、细胞或组织加 Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解。。 2、12,000rpm 离心 10min，弃沉淀。 3、按 200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，上下颠倒混匀后冰上放置5min。 4、4℃ 12,000g 离心 15min。 5、吸取上层水相，至另一离心管中 6、按 0.5ml 异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，冰浴放置10min。 7、4℃ 12,000g 离心 10min，弃上清，RNA 沉于管底。 8、按 1ml 75%乙醇/ml Trizol 加入 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 9、 4℃ 8,000g 离心 5min，尽量弃上清。 10、室温晾干或真空干燥 5-10min。注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解。 11、可用 30ul DEPC处理水溶解RNA样品 |
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