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小茶91520

铜虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
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虫号: 1468277
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性别: GG
专业: 微生物遗传育种学

[求助] 各位虫友能帮忙分析下我提取的果实RNA问题可能出在哪吗？已有9人参与

操作步骤
1) 取 800ul 提取缓冲液加入 2ml 离心管中，预热至 65℃
2) 取新鲜样品放入研钵，在液氮中迅速研磨成粉末状。
3) 迅速将 50-100mg 粉末状样品转入预热的提取缓冲液中，涡旋振荡器混匀，65℃水浴 10min，每隔 2min 混匀一次。
4) 水浴结束后，冷却至室温。
5) 向离心管中加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋振荡器充分混匀，冰浴10min。
6) 离心管在 4℃下 12000×g 离心 10min。
7) 取上清，转入新的 2ml 离心管，重复操作(5)、 (6)。注：如果中间层仍有物质，可以继续重复步骤（ 5）和（ 6），直至中间层较干净为止（但最多抽提 4 次，过柱时抽提 3 次，否组次数太多会降解）。
8) 取上清，转入新的 1.5ml 离心管中，加入 1/3 体积的 8M LiCl，混匀，加入等体积的异丙醇，混匀，放入-20℃冰箱1小时。
9) 4℃， 12000×g 离心 15 min。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。
10) 向 RNA 沉淀中加入 1ml 75％乙醇，漩涡振荡器上振荡混匀 5s， 4oC， 7500×g离心 5min，弃上清。
11) 4oC， 7500×g 离心 1min，用枪头小心吸弃多余液体。

提取了很多次，效果都不好！恳请各位帮忙分析一下！图中间是mark，右边是实验提取的RNA。是不是RNA降解的太厉害？还是DNA降解所出现的拖尾现象？

IMG_2443.JPG

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1楼 2015-06-16 17:01:55

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lichj

铜虫 (初入文坛)

应助: 6 (幼儿园)
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注册: 2006-04-11
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小茶91520: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-06-17 16:36:38

从图上看RNA明显降解了。不知道你的试剂是什么配方，植物中富含多酚和多糖，果实中多糖含量很高，用常用试剂通常效果不好，现在有很多文献，里面是一些改良方法，比如加入PVP除酚类物质，巯基乙醇防止氧化，licl是可以除多糖的，但是它在沉淀RNA的时候是选择性沉淀分子量大的RNA，一些低分子量的可能会丢失，你如果做小RNA，或tRNA类的研究最好不用此方法，可以用终浓度10%的乙醇离心去除多糖。多查查文献吧，我们提这一类的植物RNA都是自己配制的试剂，比试剂盒好一些。