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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 各位虫友能帮忙分析下我提取的果实RNA问题可能出在哪吗？
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小茶91520

铜虫 (小有名气)

[求助] 各位虫友能帮忙分析下我提取的果实RNA问题可能出在哪吗？ 已有9人参与

操作步骤
1) 取 800ul 提取缓冲液加入 2ml 离心管中，预热至 65℃
2) 取新鲜样品放入研钵，在液氮中迅速研磨成粉末状。
3) 迅速将 50-100mg 粉末状样品转入预热的提取缓冲液中， 涡旋振荡器混匀，65℃水浴 10min，每隔 2min 混匀一次。
4) 水浴结束后， 冷却至室温。
5) 向离心管中加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)， 涡旋振荡器充分混匀，冰浴10min。
6) 离心管在 4℃下 12000×g 离心 10min。
7) 取上清，转入新的 2ml 离心管，重复操作(5)、 (6)。注：如果中间层仍有物质，可以继续重复步骤（ 5）和（ 6），直至中间层较干净为止（但最多抽提 4 次，过柱时抽提 3 次，否组次数太多会降解）。
8) 取上清，转入新的 1.5ml 离心管中， 加入 1/3 体积的 8M LiCl，混匀，加入等体积的异丙醇，混匀， 放入-20℃冰箱1小时。
9) 4℃， 12000×g 离心 15 min。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。
10) 向 RNA 沉淀中加入 1ml 75％乙醇， 漩涡振荡器上振荡混匀 5s， 4oC， 7500×g离心 5min，弃上清。
11) 4oC， 7500×g 离心 1min，用枪头小心吸弃多余液体。


提取了很多次，效果都不好！恳请各位帮忙分析一下！图中间是mark，右边是实验提取的RNA。是不是RNA降解的太厉害？还是DNA降解所出现的拖尾现象？

各位虫友能帮忙分析下我提取的果实RNA问题可能出在哪吗？
IMG_2443.JPG
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1楼 2015-06-16 17:01:55
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还可以，不是太差，可以反转录，pcr试试

[ 发自小木虫客户端 ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
5楼2015-06-17 00:08:21
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-17 22:51:24
从图上看，不知道你的marker多大，感觉更像DNA条带。
你的提取方法以前成功过吗？何不试试Ｔｒｉｚｏｌ或是现在很多的试剂盒？
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2楼2015-06-16 20:17:46
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小茶91520

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-06-16 20:17:46
从图上看，不知道你的marker多大，感觉更像DNA条带。
你的提取方法以前成功过吗？何不试试Ｔｒｉｚｏｌ或是现在很多的试剂盒？

2000的mark，这是做转录组时公司给的提取方法。这东西真难提取！
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3楼2015-06-16 21:50:04
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这是提DNA啊，只能说，你还没掌握CTAB法提RNA

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2015-06-16 23:34:49
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