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RNA提取，DNA提取，PCR扩增，变性凝胶电泳，高通量测序的具体步骤
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Breeze_liang
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2楼2015-06-16 09:26:18
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16S中的"S"是一个沉降系数,亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标,值越高,说明分子越大. rDNA 和rRNA中的小写字母"r"是ribosome(核糖体)的缩写. rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列,也就是编码16S rRNA的基因. rRNA指的是rDNA的转录产物,它是构成核糖体的重要成分,核糖体由许多小的rRNA分子组装而成,16S rRNA是其中一个组件. 一般所分析的对象都是16s rDNA,因为DNA提取容易,也比较稳定. 来自https://zuoye.baidu.com/question ... 3162adf37e1c88.html |
3楼2015-06-23 10:47:34
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引物是一段短的单链RNA或DNA片段,可结合在核酸链上与之互补的区域,其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链.体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等. 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列,一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补,另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补. 在PCR（聚合酶链式反应）技术中,已知一段目的基因的核苷酸序列,根据这一序列合成引物,利用PCR扩增技术,目的基因DNA受热变性后解链为单链,引物与单链相应互补序列结合,然后在DNA聚合酶作用下进行延伸,如此重复循环,延伸后得到的产物同样可以和引物结合 |
4楼2015-06-23 11:05:17
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DNA提取方法为用Fast DNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）试剂盒提取样品中微生物的总DNA，将提取得到的DNA溶解于70 μL无菌TE缓冲液（10 mmol L-1 Tris-HCl，1 mmol L-1 EDTA，pH 8.0），详细操作步骤参考试剂盒说明书。通过微量紫外分光光度计（NanoDrop ND-1000 UV-Vis）测定DNA浓度和纯度（OD260 /OD280和OD260 /OD230）。利用TE缓冲液将样品中总DNA进行10倍梯度稀释后，进行PCR扩增，通过凝胶电泳分析样品DNA中可能存在的腐殖质及其对PCR扩增的影响。土壤DNA保存于-20 °C冰箱中待用。 针对从湖泊沉积物、草甸和盐碱土中提取的DNA，首先利用通用引物（515 F和907 R）扩增其中的微生物16S rRNA基因，随后纯化PCR产物，步骤如下：0. 25 μL的TaKaRa Ex Taq HS（5 U μL-1），5.0 μL的10×Buffer（Mg2+ Plus），4. 0 μL的dNTP 混合物（各2.5 mmol L-1），1.0 μL的20 μmol L-1引物，加入2.0 μL稀释10倍的DNA模板至50 μL反应体系，每次PCR反应均设置无菌水的阴性对照。PCR扩增条件为：94 °C，5 min；（94 °C，30 s；55 °C， 30 s；72 °C，45 s），33个循环；72 °C 10 min。获得扩增产物后，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0试剂盒( TaKaRa) 进行切胶纯化，并将其溶于 30 μL DNase-free H2O。进一步通过2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物纯化效果，测定纯化后PCR产物的浓度。 DGGE指纹图谱分析，取3.0 μL的PCR产物，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳PCR扩增特异性。进一步利用NanoDrop定量PCR产物，每个样品采用约150 ng 的16S rRNA基因PCR产物进行DGGE分析。DGGE聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性梯度范围为45%-70%。电泳条件为0.5×TAE缓冲液，80V电压、60 °C电泳16 h。电泳分析通过Bio-Rad D-Code System完成后，利用SYBR染料染色30 min，进行后续分析。 DGGE变性梯度凝胶利用Bio-Rad公司的凝胶成像系统（Quantity One Bio-Rad，USA）在紫外光下拍摄电泳图片。将DGGE凝胶上肉眼可辨的优势条带仔细切下并置于0.5 mL离心试管。利用50 μL的无菌水反复冲洗3次，并通过移液器枪头将其尽量捣碎后加入20 μL无菌水4 °C浸泡过夜。取2.0 μL上清液作为模板，进一步利用引物GC clamp-515F和907 R 进行PCR扩增。PCR扩 增体系和反应条件如前所述。将PCR产物链接到Peasy-T3载体（Trans）并转化到E. coli DH5α感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB培养基上选择具有Amp + 抗性的白色转化子。通过M13F和M13R载体引物进行PCR扩增以验证阳性克隆。每个DGGE条带选择2-3个阳性克隆用于测序。在80%的置信水平通过RDP Classifier进行分类，鉴定到门、纲、目、科和属不同水平。 DGGE电泳图谱，运用Quantity One软件，建立泳道，排除背景干扰，建立并校正条带，最后自动生成定量报告。报告中包括每个条带的轨迹定量值Trace（Int×mm），由条带的光密度和峰面积自动计算得到。 根据Pi = ni /N，计算DGGE相对丰度Pi。其中，ni为每个条带的轨迹定量值，N为所有条带的轨迹定量值ni之和。再计算Shannon多样性指数。 |
5楼2015-06-24 15:21:00
6楼2015-06-25 11:00:07
7楼2015-06-28 13:26:37
yhk1008
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8楼2015-06-28 20:49:38
圆圆_0212
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