| 查看: 2918 | 回复: 8 | ||
c221amo实习版主
逍遥子
|
[求助]
RNA提取，DNA提取，PCR扩增，变性凝胶电泳，高通量测序的具体步骤
|
| 求助实验方法，RNA提取，DNA提取，PCR扩增，变性凝胶电泳，高通量测序的具体步骤，具体到添加试剂，仪器等 |
回复此楼» 猜你喜欢
307分求调剂
已经有12人回复
-
0817化工学硕调剂
已经有9人回复
-
319求调剂
已经有6人回复
-
320分，材料与化工专业，求调剂
已经有16人回复
-
316求调剂
已经有10人回复
-
291求调剂
已经有19人回复
-
353求调剂
已经有4人回复
-
08生物与医药专硕初试346找调剂
已经有4人回复
-
337求调剂
已经有9人回复
-
生物与医药考研调剂
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请问提取细菌基因组DNA需要去除RNA吗
已经有11人回复
- 反转录RNA时出现基因组DNA的原因有哪些？
已经有10人回复
- 求助宏基因组高通量测序微生态研究
已经有11人回复
- 关于PCR中测RNA完整性的琼脂糖变性凝胶电泳实验
已经有12人回复
- RNA提取后跑胶泳道条带弥散，有亮带，请教这是什么原因呢？
已经有26人回复
- 动物组织冻存，做PCR和western，以及提取RNA和蛋白步骤
已经有3人回复
- 总RNA提取完跑电泳步骤
已经有16人回复
- PCR琼脂糖凝胶电泳图希望大家帮我分析一下
已经有12人回复
- DNA凝胶电泳图
已经有17人回复
- 提取总DNA出现RNA污染，会不会影响后续PCR及测序问题
已经有8人回复
- 提取的RNA样本，经过DNA酶处理，但总是处理不干净
已经有12人回复
- 提取DNA后，PCR电泳无条带
已经有5人回复
- DNA提取过程中的RNA消化
已经有4人回复
- RNA电泳和PCR产物电泳中加的buffer是一样的吗
已经有15人回复
- 土壤DNA提取，真菌通用引物PCR，琼脂糖电泳图，感觉有问题，新手求助
已经有7人回复
- rna终于提取出来了，可是反转录pcr（rt pcr）没有条带
已经有19人回复
- 提取RNA电泳上样量
已经有21人回复
- 求助 高通量测序
已经有3人回复
- 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
已经有18人回复
- RNA非变性琼脂糖电泳
已经有26人回复
- 【求助/交流】DNA提取方法（用于PCR-DGGE）
已经有20人回复
- 【求助/交流】有意思的rna非变性凝胶电泳-之真相大白
已经有10人回复
- 【转帖】PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定
已经有67人回复
Breeze_liang
主管区长
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 2814.6
- 散金: 234
- 红花: 3
- 帖子: 371
- 在线: 70.3小时
- 虫号: 3041687
- 注册: 2014-03-09
- 性别: GG
- 专业: 半导体光电子器件
2楼2015-06-16 09:26:18
c221amo
专家顾问
逍遥子
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 42.2
- 散金: 1296
- 红花: 5
- 帖子: 857
- 在线: 67.3小时
- 虫号: 2232147
- 注册: 2013-01-09
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
|
16S中的"S"是一个沉降系数,亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标,值越高,说明分子越大. rDNA 和rRNA中的小写字母"r"是ribosome(核糖体)的缩写. rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列,也就是编码16S rRNA的基因. rRNA指的是rDNA的转录产物,它是构成核糖体的重要成分,核糖体由许多小的rRNA分子组装而成,16S rRNA是其中一个组件. 一般所分析的对象都是16s rDNA,因为DNA提取容易,也比较稳定. 来自https://zuoye.baidu.com/question ... 3162adf37e1c88.html |
3楼2015-06-23 10:47:34
c221amo
管理员
逍遥子
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 42.2
- 散金: 1296
- 红花: 5
- 帖子: 857
- 在线: 67.3小时
- 虫号: 2232147
- 注册: 2013-01-09
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
|
引物是一段短的单链RNA或DNA片段,可结合在核酸链上与之互补的区域,其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链.体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等. 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列,一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补,另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补. 在PCR（聚合酶链式反应）技术中,已知一段目的基因的核苷酸序列,根据这一序列合成引物,利用PCR扩增技术,目的基因DNA受热变性后解链为单链,引物与单链相应互补序列结合,然后在DNA聚合酶作用下进行延伸,如此重复循环,延伸后得到的产物同样可以和引物结合 |
4楼2015-06-23 11:05:17
c221amo
实习版主
逍遥子
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 42.2
- 散金: 1296
- 红花: 5
- 帖子: 857
- 在线: 67.3小时
- 虫号: 2232147
- 注册: 2013-01-09
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
|
DNA提取方法为用Fast DNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）试剂盒提取样品中微生物的总DNA，将提取得到的DNA溶解于70 μL无菌TE缓冲液（10 mmol L-1 Tris-HCl，1 mmol L-1 EDTA，pH 8.0），详细操作步骤参考试剂盒说明书。通过微量紫外分光光度计（NanoDrop ND-1000 UV-Vis）测定DNA浓度和纯度（OD260 /OD280和OD260 /OD230）。利用TE缓冲液将样品中总DNA进行10倍梯度稀释后，进行PCR扩增，通过凝胶电泳分析样品DNA中可能存在的腐殖质及其对PCR扩增的影响。土壤DNA保存于-20 °C冰箱中待用。 针对从湖泊沉积物、草甸和盐碱土中提取的DNA，首先利用通用引物（515 F和907 R）扩增其中的微生物16S rRNA基因，随后纯化PCR产物，步骤如下：0. 25 μL的TaKaRa Ex Taq HS（5 U μL-1），5.0 μL的10×Buffer（Mg2+ Plus），4. 0 μL的dNTP 混合物（各2.5 mmol L-1），1.0 μL的20 μmol L-1引物，加入2.0 μL稀释10倍的DNA模板至50 μL反应体系，每次PCR反应均设置无菌水的阴性对照。PCR扩增条件为：94 °C，5 min；（94 °C，30 s；55 °C， 30 s；72 °C，45 s），33个循环；72 °C 10 min。获得扩增产物后，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0试剂盒( TaKaRa) 进行切胶纯化，并将其溶于 30 μL DNase-free H2O。进一步通过2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物纯化效果，测定纯化后PCR产物的浓度。 DGGE指纹图谱分析，取3.0 μL的PCR产物，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳PCR扩增特异性。进一步利用NanoDrop定量PCR产物，每个样品采用约150 ng 的16S rRNA基因PCR产物进行DGGE分析。DGGE聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性梯度范围为45%-70%。电泳条件为0.5×TAE缓冲液，80V电压、60 °C电泳16 h。电泳分析通过Bio-Rad D-Code System完成后，利用SYBR染料染色30 min，进行后续分析。 DGGE变性梯度凝胶利用Bio-Rad公司的凝胶成像系统（Quantity One Bio-Rad，USA）在紫外光下拍摄电泳图片。将DGGE凝胶上肉眼可辨的优势条带仔细切下并置于0.5 mL离心试管。利用50 μL的无菌水反复冲洗3次，并通过移液器枪头将其尽量捣碎后加入20 μL无菌水4 °C浸泡过夜。取2.0 μL上清液作为模板，进一步利用引物GC clamp-515F和907 R 进行PCR扩增。PCR扩 增体系和反应条件如前所述。将PCR产物链接到Peasy-T3载体（Trans）并转化到E. coli DH5α感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB培养基上选择具有Amp + 抗性的白色转化子。通过M13F和M13R载体引物进行PCR扩增以验证阳性克隆。每个DGGE条带选择2-3个阳性克隆用于测序。在80%的置信水平通过RDP Classifier进行分类，鉴定到门、纲、目、科和属不同水平。 DGGE电泳图谱，运用Quantity One软件，建立泳道，排除背景干扰，建立并校正条带，最后自动生成定量报告。报告中包括每个条带的轨迹定量值Trace（Int×mm），由条带的光密度和峰面积自动计算得到。 根据Pi = ni /N，计算DGGE相对丰度Pi。其中，ni为每个条带的轨迹定量值，N为所有条带的轨迹定量值ni之和。再计算Shannon多样性指数。 |
5楼2015-06-24 15:21:00
c221amo
兑换贵宾
逍遥子
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 42.2
- 散金: 1296
- 红花: 5
- 帖子: 857
- 在线: 67.3小时
- 虫号: 2232147
- 注册: 2013-01-09
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
6楼2015-06-25 11:00:07
c221amo
管理员
逍遥子
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 42.2
- 散金: 1296
- 红花: 5
- 帖子: 857
- 在线: 67.3小时
- 虫号: 2232147
- 注册: 2013-01-09
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
7楼2015-06-28 13:26:37
8楼2015-06-28 20:49:38
9楼2015-07-21 09:05:35
