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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于PCR中测RNA完整性的琼脂糖变性凝胶电泳实验
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lanlvmaomao

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于PCR中测RNA完整性的琼脂糖变性凝胶电泳实验已有4人参与

最近要做QRTPCR，RNA提取后想测下RNA完整性，RNA琼脂糖变性凝胶电泳实验的方案搜索了很多用TAE TBE MOPS缓冲液的都有。筒子们谁做过，能提供给一份详细点的试验流程的，万分感谢啊
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1楼2014-02-26 23:49:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
什么物种的RNA？
可以跑Agilent Bioanalyzer 2100，会直接给一个RIN值，根据这个判断RNA完整性，是很常用并且被广泛接受的方法。
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5楼2014-02-27 15:41:38
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lanlvmaomao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2014-02-27 13:02:10
....
    最标准的是用甲醛变性电泳，如果嫌麻烦，就用普通TAE/TBE琼脂糖电泳就成了，主要注意清洗好槽子、梳子制胶盒等，一般是拿高浓度NaOH来泡，DEPC水冲

TAE缓冲液怎么配置呢，我没有跑过DNA电泳。。。
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6楼2014-02-27 15:50:15
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tangqing小木

金虫 (初入文坛)
★
lanlvmaomao(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励交流 2014-02-28 22:01:08
引用回帖:
8楼: Originally posted by lanlvmaomao at 2014-02-27 21:41:55
非常感谢，我想用TEB也没什么关系吧...

正规做RNA电泳应该使用MOPS缓冲液（含甲醛），而且所有的器具需用DEPC水处理，以防RNA降解，MOPS不贵，如果需要可参照分子克隆实验指南自己配制。如果RNA电泳只是观察RNA是否完整，以后实验需要，用普通跑胶也能出来，就是用TBE了，我们也做过，没问题，注意器具一般清洁，跑胶时间不要太长，可以的，用1.5%的胶。
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9楼2014-02-28 09:13:23
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tangqing小木

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lanlvmaomao at 2014-02-28 09:19:22
是的，我只是想看看RNA是否完整，那您说我还需要点maker么，需要的话，是把买的maker直接加到点样孔么，非常感谢啦...

MARKER是不需要的
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11楼2014-02-28 09:29:09
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普通回帖

yyshpy007

禁虫 (正式写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-27 11:00:16
本帖内容被屏蔽
2楼2014-02-27 02:38:54
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励交流 2014-02-28 22:02:53
正如楼上所说，的确是跟跑DNA是一样的，配1.5%左右的胶，用1X TAE跑就可以了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2014-02-27 11:00:10
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★
lanlvmaomao(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励交流 2014-02-28 22:02:24
....
    最标准的是用甲醛变性电泳，如果嫌麻烦，就用普通TAE/TBE琼脂糖电泳就成了，主要注意清洗好槽子、梳子制胶盒等，一般是拿高浓度NaOH来泡，DEPC水冲
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Let God do with it as He wills
4楼2014-02-27 13:02:10
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tangqing小木

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lanlvmaomao(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-02-28 22:02:01
实验步骤：
(1)用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
    (2)在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
    (3)打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
试剂：
    (1)MOPS缓冲液(10*):0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。
    (2)上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。
    (3)甲醛。
    (4)去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。
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7楼2014-02-27 16:14:09
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lanlvmaomao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by tangqing小木 at 2014-02-27 16:14:09
实验步骤：
(1)用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
    (2)在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样 ...

非常感谢，我想用TEB也没什么关系吧
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8楼2014-02-27 21:41:55
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lanlvmaomao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by tangqing小木 at 2014-02-28 09:13:23
正规做RNA电泳应该使用MOPS缓冲液（含甲醛），而且所有的器具需用DEPC水处理，以防RNA降解，MOPS不贵，如果需要可参照分子克隆实验指南自己配制。如果RNA电泳只是观察RNA是否完整，以后实验需要，用普通跑胶也能出 ...

是的，我只是想看看RNA是否完整，那您说我还需要点maker么，需要的话，是把买的maker直接加到点样孔么，非常感谢啦
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10楼2014-02-28 09:19:22
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