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308047410

新虫 (小有名气)

[求助] RNA提取电泳图,不知道什么原因。求原因

采用Trizol试剂(Invitrogen,USA)提取各组织总RNA。
1)  用液氮将研钵预冷,待液氮挥发速度变慢,取适量消化腺组织(约 50mg)
放入其中,研磨组织;
2)  待样品无明显颗粒后转入已加入 1mlTrizol 的 1.5ml 离心管中,混匀后,室
温静置 10min;
3)  在管中加入 200μl 三氯甲烷,用涡旋震荡器剧烈震荡 15s 后,冰上静置 5min;
4)  以 12,000 rpm 转速 4℃冷冻离心 15min 后,弃上清液,加入与上清液等量的
异丙醇,迅速混匀;
5)  12,000 rpm 4℃冷冻离心 20min;
6)  弃去上清液,加入 1ml 75%乙醇(现用现配),8000rpm 4℃冷冻离心 10min;
7)  弃掉上清液,然后将沉淀置于室温晾干 5-10min,使残余乙醇尽可能挥发,
取事先预热 DEPC-H2O,取 30μl 溶解 RNA 沉淀。
以上是我采用 的方法,得到的电泳图如下:
由于第一次做,请各位给予指导和 建议。

RNA提取电泳图,不知道什么原因。求原因
Cache_50175fbd4703b621.jpg
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xiaoyangren7

金虫 (小有名气)

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感谢参与,应助指数 +1
取事先预热 DEPC-H2O?要预冷的DEPC水吧,建议整个过程冰上操作,天气热的情况下,室温晾干那一步要注意,久了RNA就降解了,样品多来不及可以把晾干的先全部加了水再慢慢混匀
8楼2015-06-10 08:50:44
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sonyangg

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
明显降解了,天气热,容易出汗,RNA酶满天飘,在超净台或者专门的提取室提取吧
10楼2015-06-10 10:35:38
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gnot_nail

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
308047410: 金币+2, 有帮助 2015-06-10 23:42:35
跑胶的电泳液以及胶 都最好用DEPC来配置溶解。
11楼2015-06-10 11:20:30
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樊华易逝

铁虫 (小有名气)

从以下几方面看看。1、是否低温(比如酒精等是否遇冷)2、RNA降解酶来源(不用Trizo后注意,手套勤换,超净台)3、提取成功,跑胶时降解(跑胶液新置,时间不能太长)

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14楼2015-06-11 06:28:07
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普通回帖

ThinkerDay

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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308047410: 金币+2, 有帮助 2015-06-10 23:43:28
电泳时间多少,凝胶浓度多少?

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2015-06-08 13:30:37
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ThinkerDay

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

marker是多少的?

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-06-08 13:31:29
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308047410

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ThinkerDay at 2015-06-08 13:30:37
电泳时间多少,凝胶浓度多少?

电泳时间:10分钟,marker:2000的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2015-06-08 21:49:30
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308047410

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 308047410 at 2015-06-08 21:49:30
电泳时间:10分钟,marker:2000的
...

凝胶浓度1%

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2015-06-08 21:49:58
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lichj

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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308047410: 金币+4, ★★★很有帮助 2015-06-10 23:44:28
从胶图上看你的RNA已经严重降解了。最下面那团很亮的应该就是降解的碎片,另外电泳时间有些短,至少应该等marker条带分开以后再照相。电泳前应该先测一下OD值,通常上样量100-200ng就足够了,上样量过多有时条带反而跑不开。我常提RNA,用DEPC水溶解时没必要预热。RNA降解的原因有很多种,样品本身采集的时候有问题,或者操作不当,流程基本没什么大问题但是很多细节问题在流程上是反应不出来的。
6楼2015-06-09 18:56:04
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)

降解啦。。。建议买个试剂盒。。。

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2015-06-09 20:32:14
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不羁的仰光

新虫 (初入文坛)

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感谢参与,应助指数 +1
RNA酶抑制剂有问题

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2015-06-10 09:22:02
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