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[交流]
PCR相关问题解答
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近期，很多新虫友问到与PCR相关的问题，共同点只有一个：P不出来。这个过程很煎熬，从事分子生物学稍微久一点的虫子都知道，这都是说起来容易做起来难的工作。基于我多年的经验和教训，大致原因总结如下： 1. 最可能出现的问题是引物特异性。一般DNA/RNA/质粒提取，不会出现太大问题的话，引物特异性是决定PCR成败的首要因素。所以在设计引物的时候，一定要谨慎，严格按照引物设计的原则来进行，尤其是刚刚涉及本领域的虫友们，还是按照规矩来比较好。很多虫友可能是拿到别人设计的引物来做扩增，这个时候最好是拿到引物设计的最初资源，或者自己再用Primer去检测一下，确认之后再做扩增，这对你后面的分析会有很大帮助。 2. 反应体系的优化。反应体系对PCR扩增的决定也是至关重要的，选择合适的扩增酶和其对应的酶buffer是反应体系合理的首要因素。不同的实验目的对酶的选择有针对性，若只是检测，检测条带有无或大小，可用普通的扩增酶即可；若是需要测序，进行后续实验，i就要选取高保真酶；一些特殊的目的片段可能需要选取一些特殊的酶来进行扩增。各大扩增酶供应现在都比较齐全和成熟，大可与供应商联系交流，选择合适自己的酶。其他几个组分也需要注意，如Mg2+是否有加，dNTP是否有效，模板是否合适。反应体系的优化是个排除法，做得出来，你一般不会注意。但做不出来，就要一一排除。 3. 反应程序的选择。不同的扩增酶对应着不同的反应程序，看好protocal再进行程序设置。这里最需要注意的可能就是退火温度的选择，通常来说，退火温度使用你设计引物时的温度，如果不合适，可能就要做梯度，这个过程也比较繁琐。个人教训是先关注降低3-5度的结果，若还没结果，可能就要做上下10度的梯度PCR。 4. 凝胶的制备和电泳。很多虫友上传一张凝胶电泳图问原因，这个一般很难解答到底哪个地方出错了，最可能的就是上述三点的问题。但是凝胶的制备也会影响你最终成像的结果，凝胶的低浓度，EB的量，凝胶孔的大小，电压的大小都会影响到你最终图片的效果。 总之，PCR是个分子生物学的一个基本技术。粗略总结起来，就以上几点。还是那句话，顺利的时候，一次性就出来了；但只有不顺利，才会让你找原因，才会理解和进步。这是个人的教训总结，希望对大家有用。 |
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