| 查看: 2861 | 回复: 20 | |||||||
[交流]
PCR相关问题解答
|
|||||||
|
近期，很多新虫友问到与PCR相关的问题，共同点只有一个：P不出来。这个过程很煎熬，从事分子生物学稍微久一点的虫子都知道，这都是说起来容易做起来难的工作。基于我多年的经验和教训，大致原因总结如下： 1. 最可能出现的问题是引物特异性。一般DNA/RNA/质粒提取，不会出现太大问题的话，引物特异性是决定PCR成败的首要因素。所以在设计引物的时候，一定要谨慎，严格按照引物设计的原则来进行，尤其是刚刚涉及本领域的虫友们，还是按照规矩来比较好。很多虫友可能是拿到别人设计的引物来做扩增，这个时候最好是拿到引物设计的最初资源，或者自己再用Primer去检测一下，确认之后再做扩增，这对你后面的分析会有很大帮助。 2. 反应体系的优化。反应体系对PCR扩增的决定也是至关重要的，选择合适的扩增酶和其对应的酶buffer是反应体系合理的首要因素。不同的实验目的对酶的选择有针对性，若只是检测，检测条带有无或大小，可用普通的扩增酶即可；若是需要测序，进行后续实验，i就要选取高保真酶；一些特殊的目的片段可能需要选取一些特殊的酶来进行扩增。各大扩增酶供应现在都比较齐全和成熟，大可与供应商联系交流，选择合适自己的酶。其他几个组分也需要注意，如Mg2+是否有加，dNTP是否有效，模板是否合适。反应体系的优化是个排除法，做得出来，你一般不会注意。但做不出来，就要一一排除。 3. 反应程序的选择。不同的扩增酶对应着不同的反应程序，看好protocal再进行程序设置。这里最需要注意的可能就是退火温度的选择，通常来说，退火温度使用你设计引物时的温度，如果不合适，可能就要做梯度，这个过程也比较繁琐。个人教训是先关注降低3-5度的结果，若还没结果，可能就要做上下10度的梯度PCR。 4. 凝胶的制备和电泳。很多虫友上传一张凝胶电泳图问原因，这个一般很难解答到底哪个地方出错了，最可能的就是上述三点的问题。但是凝胶的制备也会影响你最终成像的结果，凝胶的低浓度，EB的量，凝胶孔的大小，电压的大小都会影响到你最终图片的效果。 总之，PCR是个分子生物学的一个基本技术。粗略总结起来，就以上几点。还是那句话，顺利的时候，一次性就出来了；但只有不顺利，才会让你找原因，才会理解和进步。这是个人的教训总结，希望对大家有用。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生物知识 | 分子生物学 | 分子生物 | 科研相关 |
» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有161人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 荧光定量PCR内参问题
已经有3人回复
- 如何构建PCR反应体系、PCR反应条件
已经有11人回复
- 多重PCR与普通PCR反应的差别主要是什么
已经有9人回复
- 请教关于qRT-PCR对照设置的一些问题
已经有7人回复
- 新手做荧光定量PCR几个疑问求解答！！
已经有13人回复
- 请问qRT-PCR的标准曲线中扩增效率过高是怎么回事
已经有8人回复
- 菌液pcr总是做不出！求高手解答！
已经有18人回复
- 相对定量PCR对照组的bar问题，急求解答，在线等！
已经有14人回复
- 有关RT-PCR模板RNA量的问题，请高手解答！！！
已经有16人回复
- PCR出现非特异性扩增，求高手解答
已经有9人回复
- 关于qPCR的几个问题，求解答
已经有3人回复
- IQ5 RT-QPCR问题求助
已经有8人回复
- PCR标准体系有关问题。。求高手解答
已经有5人回复
- PCR引物的量如何确定，求助高手指教
已经有11人回复
- 荧光定量PCR-最全的疑难问题解答！！！
已经有294人回复
- 大片段PCR扩增求助
已经有34人回复
- RNA出现降解，还能做后面的荧光定量PCR吗？
已经有22人回复
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已经有15人回复
- 【资料】分子生物学常见问题解答
已经有30人回复
- 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？
已经有20人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
浙江师范大学数理医学招聘专任教师
+5/325
-
国家“千人计划”青年项目获得者团队接收化学、高分子、材料等学科研究生调剂
+1/289
-
2007年一起玩耍的老虫子们，想死你们啦~~~出来冒个泡吧……
+2/188
-
物理学 调剂
+1/92
-
宁波大学2026年紧急补招植保方向（昆虫或植病）博士研究生1-2名
+1/88
-
西安石油大学新能源学院接收材料类、能源动力类、机械类、计算机类等专业专硕调剂生！
+1/87
-
湖北大学生科院邢琼老师课题组招硕士/博士,目前还有调剂名额！
+1/40
-
西交利物浦大学黄彪院士招收26年全奖博士生1名（工业系统数字孪生方向）
+1/39
-
福建理工大学招收环境、化工、能源动力、新能源科学与工程、材料、机械等学科背景
+1/38
-
北京石油化工学院天然高分子与生物材料组招收0817化学工程与技术及0856材料与化工调剂
+1/11
-
大连大学 化学专业 招收26年硕士研究生调剂
+1/11
-
浙江衢州，化材调剂信息（欢迎0854电气、0855机械、0856及各位符合的同学咨询哦）
+1/7
-
Postdoc position in continuum mechanics of brain tissue at KTH in Stockholm
+1/7
-
材料与环境相关的考生可调剂到杭州电子科技大学
+1/6
-
鲁东大学-滨海生态高等研究院-水产专业考研调剂（理学、农学可调）
+1/5
-
不打卡-弹性工作制课题组招生
+1/4
-
大连工业大学“轻工技术与工程”“ 制浆造纸与生物质精炼”领域石海强教授课题组招收
+1/4
-
2026年北京服装学院- 纺织化学与染整工程-刘老师可招收化学相关专业考研调剂
+1/4
-
淮北师范大学能源科学与工程学院研究生招收调剂
+1/3
-
齐鲁工业大学轻工学部 招收材料与化工调剂
+1/2
2楼2015-05-16 11:17:56
3楼2015-05-16 13:27:00
4楼2015-05-16 19:23:28
5楼2015-05-17 16:23:00
9楼2015-05-22 13:47:37
10楼2015-05-28 16:46:53
11楼2015-06-03 17:09:38
12楼2015-08-26 10:35:42
13楼2015-08-26 23:41:39
14楼2015-09-01 10:26:52
15楼2015-09-01 16:25:20
16楼2015-09-01 21:23:20
17楼2015-09-02 07:52:46
18楼2016-09-06 20:52:02
20楼2017-04-26 16:11:30
21楼2017-04-26 16:35:45
简单回复
dmbb6楼
2015-05-22 09:28
回复
晞朔(金币+1): 谢谢参与
寻找cock7楼
2015-05-22 09:54
回复
月伴沙滩8楼
2015-05-22 09:57
回复
魔鬼的天使19楼
2016-09-07 16:10
回复
